诺如病毒疫情分子的流行病学特征范文

摘要：目的了解深圳市光明新区诺如病毒疫情暴发的病原体基因分型情况和分子流行病学特征。方法收集2016年12月至2017年3月感染性腹泻暴发疫情患者的肛拭子标本，通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测诺如病毒核酸，阳性标本采用巢式PCR扩增诺如病毒VP1基因区（ORF1－ORF2），PCR扩增产物经琼脂糖电泳鉴定后进行测序分析。结果9起暴发疫情共检测标本101份，诺如病毒阳性标本共54份，总阳性率为53．47％，其中GⅡ型标本52份，GⅠ型标本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染标本1份。测序成功获得48份阳性标本GⅡ型诺如病毒VP1基因序列，47份为GⅡ．P16／GⅡ．2亚型，其中45份与2016年中国香港株（KY771081）和中国广东株（KY485113）同源性最高，2份与2017年中国江苏株（KY806301）和2016年泰国清迈株（MF972308）同源性最高；1份为GⅡ．P7／GⅡ．6亚型，与2014年中国台湾株（KM267741）同源性最高。结论2017年该区诺如病毒疫情暴发的主要型别为GⅡ型，优势流行株为GⅡ．P16／GⅡ．2亚型。

关键词：诺如病毒；疫情；流行特征；分子分型

诺如病毒为杯状病毒属的单链RNA病毒，是引起全球急性肠胃炎最重要的病原体之一［1］。诺如病毒共分为GⅠ～GⅦ7个基因组和30个基因型［2］。自2014年11月起就有报道显示，在中国广东、江苏和浙江，以及日本等亚洲地区均有新型诺如病毒GⅡ．17引起的疫情暴发，对世界公共卫生造成极大的影响［3－7］。从2016年底至今，深圳地区不同区域连续暴发诺如病毒疫情引起了相关卫生部门的重视。本研究对2016年12月至2017年3月光明新区幼儿园和小学因腹泻的患者进行诺如病毒GⅠ／GⅡ／A组轮状病毒检测，检测阳性标本进一步测序分型，以了解造成疫情的主要病原体和腹泻病毒的分子特征，以期对深圳地区诺如病毒暴发的流行状况和疫情防控提供科学依据，现报道如下。

1资料与方法

1．1一般资料

采集2016年12月至2017年3月9起感染性腹泻疫情患者的肛拭子标本101份。101份标本均来自光明新区幼儿园和小学，主要临床表现为呕吐、腹痛、低热、恶心等。

1．2仪器与试剂

天隆科技全自动核酸提取仪（型号NP968－S），达安基因诺如病毒GⅠ／GⅡ／A组轮状病毒三通道核酸检测试剂盒，采用聚合酶链反应（PCR）－荧光探针法。

1．3方法

1．3．1标本前处理将肛拭子加入含有3mL标本稀释液的采样管中，混匀振荡，静置5min后进行病毒核酸检测。1．3．2病毒RNA提取吸取标本处理液200μL，采用天隆科技全自动核酸提取仪NP968－S提取病毒RNA，具体操作见说明书。1．3．3荧光定量PCR检测采用达安基因的诺如病毒GⅠ／GⅡ／A组轮状病毒三通道核酸检测试剂盒（PCR－荧光探针法）对疫情标本进行核酸快速检测。1．3．4PCR扩增阳性标本核酸采用2对扩增引物进行诺如病毒VP1基因PCR扩增，扩增片段大小为1000bp，2对PCR引物分别为GⅡPF800M：5′－GAT－GCWGAYTAYTCYMGNTGGGA－3′（4289－4311）；GⅡCR1450：5′－ACCCARGMNTCAAAYCTRAART－3′（6622－6643）；GⅡPF750M：5′－CNGCHHTAGAR－RTNATGGT－3′（4341－4359）；GⅡ－R1M：5′－CCRCC－NGCATRNCCRTTRTACAT－3′（5367－5389）。首次PCR采用引物GⅡPF800M／GⅡCR1450进行扩增，反应体系为25μL，PCR扩增条件为：45℃30min反转录，94℃5min预变性，94℃1min，47℃1min，72℃3min，35个循环后72℃7min延伸。首次PCR扩增产物采用引物GⅡPF750M／GⅡ－R1M进行二次巢式PCR扩增，反应体系为25μL，PCR扩增条件为：94℃5min预变性，94℃1min，47℃1min，72℃1．5min，29个循环后72℃7min延伸。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，大小为1000bp。1．3．5测序分析委托北京六合华大基因科技有限公司对PCR产物进行测序，测得序列结果在BLAST上进行对比寻找同源序列，并在GenBank上寻找参考株毒株。

1．4统计学处理

采用MEGA7．0软件中的Neighbor－joining方法（N－J法）构建系统进化树，选择Bootstrap程序进行1000次重复取样数目来分析进化树。

2结果

2．1流行病学调查及实验室检测结果

101份肛拭子标本经诺如病毒GⅠ／GⅡ／A组轮状病毒三通道核酸检测共获得阳性标本54份，总阳性率为53．47％，其中GⅡ型标本52份，GⅠ型标本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染标本1份。疫情暴发场所均为幼儿园和小学，高发人群为3～8岁幼年儿童，其次为青少年。暴发季节在冬春两季。

2．2VP1基因核苷酸系统进化分析

经荧光定量PCR检测出的54份阳性标本采用2对引物GⅡPF800M／GⅡCR1450和GⅡPF750M／GⅡ－R1M进行诺如病毒VP1基因PCR扩增，PCR产物经序列测定共获得48条基因序列，其余标本因保存原因或信号弱，测序未成功。成功测序的48份NoV毒株VP1基因核酸序列经比对分析见图1。在47份GⅡ．P16／GⅡ．2亚型的NoV毒株中，有45份与2016年中国香港株（KY771081）和中国广东株（KY485113）的核苷酸序列位于系统进化树上同一分支，同源性较高；2份GⅡ．P16／GⅡ．2亚型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）与2017年中国江苏NoV重组株（KY806301）和2016年泰国清迈NoV重组株（MF972308）核苷酸序列表现出高度同源性（99％），而与2016年中国香港株（KY771081）和中国广东株（KY485113）序列亲缘性较远，并非同一进化分支上。1份GⅡ．P7／GⅡ．6亚型的NoV毒株（LB201612120）与2014年中国台湾株（KM267741）的核苷酸序列位于系统进化树上同一分支，同源性高达90％以上。与其他45份GⅡ．P16／GⅡ．2亚型NoV毒株不在同一进化分支上的LB2017030310和LB2017030312NoV毒株却与GⅡ．P7／GⅡ．6亚型的NoV毒株（LB2016121260）在同一进化支上。

3讨论

诺如病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病因，同时也是引起成人腹泻的第2病因，每年导致100万人住院及20万儿童（＜5岁）死亡。伴随着轮状病毒疫苗的研制成功和逐步推广，诺如病毒有可能成为引起急性非细菌性胃肠炎和食源性疾病的首要病因。近年来，诺如病毒在世界范围内频繁暴发，中国的感染率也不断上升。本研究结果显示，深圳市光明新区2016年12月至2017年3月暴发的9起诺如病毒疫情流行高峰在冬春季，与往年报道深圳地区诺如病毒感染的暴发季节一致［8］。101份诺如病毒感染性腹泻病例以光明新区幼儿园和小学3～8岁幼年儿童为主，提示哨点监测应掌控在病毒主要的流行季节，并在相关场所做好相应防护措施。诺如病毒具有丰富的遗传多样性，其基因组全长7．5～7．8kb，包括3个开发阅读框（OORFs）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2区编码衣壳蛋白VP1，包括S区和P区，P区进一步分为P1、P2区，其中P2区域含有结合受体的关键位点和病毒抗原性表位［9］。本研究选择诺如病毒ORF1－ORF2区为靶基因，采用2对引物进行PCR扩增并进行分型测序。综合9起暴发疫情测定病例标本VP1全基因序列遗传进化分析表明，48份阳性标本中47份为GⅡ．P16／GⅡ．2亚型，其中45份与2016年中国香港株（KY771081）和中国广东株（KY485113）核苷酸同源性最高，2份与2017年中国江苏NoV重组毒株（KY806301）和2016年泰国清迈NoV重组毒株（MF972308）核苷酸同源性最高；1份为GⅡ．P7／GⅡ．6亚型，与2014年中国台湾株（KM267741）核苷酸同源性最高。2份GⅡ．P16／GⅡ．2亚型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）与1份GⅡ．P7／GⅡ．6亚型的NoV毒株（LB201612120）在同一进化分支上，提示这2株NoV毒株可能为重组株。基因重组是病毒进化的重要手段，本研究发现，NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）可能是近年来新出现的GⅡ．P16／GⅡ．2亚型重组毒株，需要引起注意。同时，探索VP1区域变异与重组的相关性对于GⅡ．2亚型流行株重组机制的研究有重要意义。近20年研究表明，诺如病毒GⅡ型是引起感染的主要基因组，GⅡ．4亚型则是最流行的基因亚型［10］。本研究结果显示，深圳市光明新区诺如病毒疫情暴发的主要型别为GⅡ型，优势流行株为GⅡ．P16／GⅡ．2亚型，并且出现2株可能为GⅡ．2亚型重组株。2016年深圳市诺如病毒主要流行株为GⅡ．2亚型，表明近2年流行株基因型由GⅡ．4亚型转变为GⅡ．2亚型；同时显示在光明新区GⅡ．2亚型毒株比其他毒株有更高的侵袭力。从2016年冬季到2017年春季，9起诺如病毒疫情在光明新区呈地区聚集性暴发，而往年并没有同类情况出现，引起这些聚集性暴发疫情的原因还有待进一步调查研究。本研究初步对深圳市光明新区诺如病毒疫情暴发的病原体基因分型情况和分子流行病学特征进行研究，为今后的预防控制积累了经验。由于深圳地区人口流动性大，而诺如病毒的基因型较多，每年都有不同的流行株，医院、学校及食堂等公共场所成为诺如病毒大肆流行的主要聚集地［11－13］。因此，长期对诺如病毒流行情况实施监测很有必要。

参考文献

［8］杨慧，李静媚，陈应坚，等．2014年深圳市龙岗区诺如病毒胃肠炎暴发的分子流行病学特征［J］．热带医学杂志，2016，16（9）：1208－1211．

［10］吴微，张宏斌，张海龙，等．2010年深圳地区诺如病毒的基因分型［J］．病毒学报，2012，28（3）：219－223．

［13］吴清平，薛亮，张菊梅．诺如病毒流行株GⅡ．4型进化研究进展［J］．微生物学报，2012，52（12）：1431－1438．

作者：钟逶迤 姚云英 李燕 姚炜 罗淑华 刘滕颖子 汪东篱 单位：广东省深圳市光明新区疾病预防控制中心