右哌甲酯贴剂体外透皮特性的考察范文

《中国医药工业杂志》2016年第四期

摘要：

建立了HPLC法测定体外透皮接收液中的右哌甲酯浓度。分别考察了右哌甲酯在不同pH值介质中的稳定性和饱和溶解度。结果表明，以pH4.5磷酸盐缓冲液为接收介质时，右哌甲酯在48h内仅降解0.17％，且满足漏槽条件。进一步考察了不同种属皮肤和不同种类促透剂对贴剂中右哌甲酯体外透皮特性的影响。结果表明，使用大鼠和裸鼠皮肤为屏障时，9h已有70％的药物透过，因此选用最难透过的巴马香猪皮肤；1,3-丙二醇、油酸、月桂氮酮、聚乙二醇400和N-甲基吡咯烷酮在5％浓度下均能略增强右哌甲酯的渗透性，但均无显著差异(P>0.05)，而薄荷醇呈现出阻碍右哌甲酯渗透的作用。

关键词：

右哌甲酯；透皮贴剂；体外透皮；促透剂

盐酸哌甲酯(methyphenidatehydrochlide)是治疗儿童注意力缺陷和多动障碍(attention-deficit/hyperactivitydisder，ADHD)的临床一线用药，通过阻断突触前神经元对去甲肾上腺素和多巴胺的再摄取，增加ADHD相关脑区的单胺类物质含量而发挥作用[1]。盐酸哌甲酯普通片剂半衰期仅2～3h，每日需多次给药[2]。为提高患者顺应性，盐酸哌甲酯缓控释胶囊(OS®MPH，美国Alza公司)和哌甲酯贴剂(Daytrana®，美国NovenTherapeutics公司)相继上市，每日仅需给药1次。近年来研究表明，其右旋体为药理活性物质，且随手性分离技术的进步，盐酸右哌甲酯缓控释胶囊(Focalin®XR，美国NovartisPharmaceuticals公司)亦获得FDA上市批准。Daytrana®采用经皮给药的途径，便于吞咽困难的口服患者使用；发生不良反应时易于移除；可防止该中枢神经系统兴奋药的滥用[1,3,4]。Focalin®XR可减少给药量，同时避免左旋体的潜在危害[4]。因此，开发右哌甲酯(demethyphenidate，1)贴剂可综合以上两产品的优势，为ADHD治疗提供更优良的制剂产品。本研究采用HPLC法测定1透皮贴剂的透皮吸收量，方法简便、快速、准确。此外，筛选了接收介质、体外皮肤模型和常用促透剂，为后期制剂的研发提供帮助。

1仪器与试药

LC-20A型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司，包括LC-20AD型溶剂输送泵、SPD-20A型紫外-可见检测器、SIL-20AC型自动进样器和LCsolution色谱工作站等)；TK-20A型透皮扩散试验仪(立式Franz扩散池，上海锴凯科技贸易有限公司)。1碱基原料药(含量98.0％，批号XLX20150421)和1盐酸盐对照品(纯度99.80％，光学纯度100％，批号XLX130508)(上海医药工业研究院)；溶剂型丙烯酸酯压敏胶DURO-TAK®(德国Henkel投资有限公司)；薇婷脱毛膏(英国利洁时集团)；N-甲基吡咯烷酮(NMP，国际特品香港有限公司)；月桂氮酮(azone，天门科捷制药有限公司)；1,3-丙二醇(PG)、聚乙二醇(PEG)400和分析纯的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、磷酸、三乙胺(国药集团化学试剂有限公司)；薄荷醇(上海新华香医料工贸有限公司)；油酸(OA，清明化工厂)；甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂为分析纯。雌性SD大鼠[(220±10)g，上海市西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2008-0016]；裸鼠[(20±2)g，雌雄不限，上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2007-0005]；雌性巴马小香猪[(7±0.3)kg，上海甲干生物科技有限公司，许可证号SCXK(沪)2010-0028]。

2方法与结果

2.1离体皮肤的制备在SD大鼠背部确定脱毛区域。先将受试动物固定好，剪短脱毛部位毛发，然后均匀涂抹脱毛膏。3～5min后用温水将脱毛部位的皮肤擦洗干净，毛巾擦干。脱毛后观察12h。皮肤发红、破损、脱毛不完全的个体剔除。大鼠颈椎脱臼处死，取下背部皮肤，小心除去皮下脂肪组织和黏连物，用生理盐水冲洗干净，无纺布吸干皮肤表面水分，选择皮肤完整的部位于-20℃保存备用。取健康裸鼠颈椎脱臼处死，立即剥离背部皮肤，小心除去皮下脂肪组织和黏连物，用生理盐水冲洗干净，无纺布吸干皮肤表面水分，选择皮肤完整的部位于-20℃保存备用。取健康2月龄巴马小香猪处死，剔除毛发后，分离背部皮肤并小心除去皮下组织，用生理盐水冲洗干净，无纺布吸干皮肤表面水分，选择皮肤完整的部位于-20℃保存备用。

2.2贴剂的制备精密称取1碱基原料药0.44g，加入无水乙醇适量，超声5min使药物全部溶解，再精密称取丙烯酸压敏胶4.8g，搅拌10min，至体系混合均匀。直接均匀涂布干燥后得对照组贴剂40贴；加入各种促透剂，继续搅拌5min后均匀涂布干燥后制得含促渗剂组贴剂。同比例无水乙醇与丙烯酸压敏胶混合均匀后，直接涂布得空白贴剂。

2.3体外分析方法的建立

2.3.1对照品贮备液配制精密称取1盐酸盐对照品13.10mg(相当于1碱基11.33mg)，置10ml量瓶中，用少量甲醇溶解后，加甲醇定容，摇匀，配制成浓度为1310g/ml的1盐酸盐对照品贮备液，置4℃冰箱中避光保存。临用前恢复至室温，再用甲醇稀释至所需浓度。

2.3.2体外透皮试验及样品处理采用透皮扩散仪进行试验，水浴温度32℃，搅拌转速300r/min，透皮面积3.14cm2，接收池体积7ml，以0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH4.5)为接收介质。将贴剂贴于皮肤角质层面，确保紧密接触无气泡后固定于扩散池。于规定时间取样0.3ml，补加同温同体积新鲜接收液并排除接收室中气泡。接收液置0.5mlEP管中，离心(12000×g)3min，取上清液，进样分析。

2.3.3色谱条件色谱柱InertsilODS-SP柱(4.6mm×250mm，5m)；流动相甲醇∶1.828g/ml磷酸二氢钾水溶液∶磷酸∶三乙胺(300∶700∶2.1∶4.2)；检测波长210nm；流速1.0ml/min；柱温40℃；进样量20l。

2.3.4专属性试验取空白接收液、对照品溶液、贴剂体外透皮样品，按“2.3.3”项下条件进样分析。结果表明，1的保留时间为15.8min，皮肤中内源性物质不干扰样品测定。

2.3.5线性试验及定量限精密量取1盐酸盐对照品贮备液适量，用空白接收液逐级稀释，配制成1碱基浓度分别为0.23、0.57、1.13、5.67、11.33、22.66、56.65和113.3g/ml的对照品溶液。按“2.3.2”项下方法处理后进样分析，以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(c)为横坐标线性回归，得回归方程为Y=36595.9453c-6032.9449，r=1.0000。表明1碱基在0.23～113.3g/ml浓度范围内线性关系良好。本法定量限(LOQ)为0.1133g/ml(S/N≥10)。

2.3.6精密度试验以空白接收液配制含1碱基浓度分别1.13、22.66和113.3g/ml的对照品溶液，各5份，按“2.3.2”项下方法处理，同1d内不同时间测定；于1周内不同时间同法测定。计算得样品的日内及日间RSD分别为1.49％(n=9)和1.68％(n=9)，表明方法精密度良好。

2.3.7回收率试验取“2.3.6”项下高、中、低浓度样品，各5份，经0.45m微孔滤膜过滤，按“2.3.2”项下方法处理后进样测定。由标准曲线计算浓度。计算得样品平均回收率为98.40％，RSD为0.28％(n=15)，符合测定要求。2.3.8稳定性试验将接收液样品分别于室温和4℃下存放，分别于0、2、4、24和48h时进样测定，记录色谱图。计算得样品峰面积的RSD为0.75％和0.46％(n=5)，表明接收液在样品于室温和4℃条件下48h内稳定。2.4接收介质的选择2.4.11碱基在接收介质中的稳定性分别以水溶液及pH4.5、5.0、5.5、5.8、6.5和6.8的PBS为溶剂，配制1碱基浓度为100g/ml的溶液，置32℃水浴中，于0、0.5、1、2、4、6、8、24和48h时取出，按“2.3.3”项下条件测定浓度，考察1碱基在不同溶液中的稳定性。结果(表1)表明，1碱基随着pH值升高，稳定性下降，在pH4.5时稳定性最好，48h内仅有0.17％降解，满足分析要求，选择此溶液为接收介质。

2.4.21碱基在接收介质中的饱和溶解度取过量的1碱基原料药置具塞试管中，分别加入适量pH4.5、5.0、5.5、5.8、6.5和6.8的PBS及蒸馏水，于32℃水浴振摇48h后取样，经0.45m微孔滤膜过滤，以甲醇稀释后按“2.3.3”项下条件测定，计算得1碱基在不同溶媒中的平衡溶解度分别为(40.12±0.37)、(34.65±0.94)、(28.78±0.14)、(11.52±0.08)、(6.00±0.06)、(4.59±0.11)和(4.38±0.16)mg/ml(n=3)。可见，随pH值降低，其饱和溶解度升高。已上市哌甲酯贴剂Daytrana®的哌甲酯含量为2.2mg/cm2，因右旋体为药理活性物质，故本品中1含量暂设计为1.1mg/cm2，1碱基完全透过后，药物浓度为0.49mg/ml，所以各接收介质均满足漏槽条件。

2.5体外透皮模型选择取对照组贴剂按“2.3.2”项下方法操作，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、9和24h定时取样。按“2.3.3”项下条件测定。4h后的样品需稀释10倍后分析。采用外标法计算单位面积累积透过量(Q)。以Q对时间t进行线性回归(因本品拟设计为缓释9h，所以采用前9h数据进行线性回归)，所得方程的斜率即为药物稳态透皮速率Js，同时计算滞后时间(tlag)及相关系数(r2)。考察了不同皮肤种属对本品中1渗透性能的影响，结果见表2和图2。结果表明，1渗透的难易顺序为猪皮、大鼠皮、裸鼠皮。使用大鼠皮与裸鼠皮时，在9h已有超过70％的药物透过皮肤，对处方优化的区分力度较差，所以选择最难透过的猪皮作为体外试验的皮肤屏障。

2.6促透剂筛选取对照贴剂和含5％不同种类促透剂(分别为月桂氮酮、NMP、薄荷醇、OA、PG和PEG400)贴剂(1.1mg/cm2)按“2.3.2”项下方法，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、9和24h定时取样处理。按“2.5”项下方法计算Js、tlag及增渗比(ER，计算公式见式①)。比较各促透剂对1的经皮促透效果，结果见表3和4。ER值结果表明，几种促透剂在9h内的促透作用次序为：PG>OA>月桂氮酮≈PEG400>NMP>薄荷醇。其中，含薄荷醇的贴剂中1的累积渗透量相比对照贴剂有所降低，说明它在浓度5％时表现为阻碍1渗透的作用。但与对照贴剂组相比，各组Js值和ER值无显著差异(P>0.05)，说明本试验中各促透剂对1的渗透行为无显著影响；除OA组外，tlag也均没有明显改变。

3讨论

3.1哌甲酯含有酯键，在水溶液中易发生水解，主要生成降解产物哌甲酸。在体外透皮接收介质的筛选中，为模拟人体体液环境，不可避免地使用水溶液作为接收介质。目前未见关于哌甲酯碱基在水溶液中稳定性的报道，吴娟等在研究盐酸哌甲酯缓释微丸时，对盐酸哌甲酯在各介质中的稳定性进行了考察，报道其在水，pH1.2盐酸，pH4.0、6.5、6.8和7.5的PBS中24h内相对稳定，但随pH值升高稳定性下降[5]。本研究表明，1碱基更不稳定，在pH值高于5.5后，24h内有明显降解。

3.2裸鼠皮、大鼠皮和猪皮因易于获得且与人体皮肤相似，经常用于透皮贴剂体外筛选，尤以猪皮与人体最为相近[6]。皮肤种属比较结果表明，1碱基渗透的难易顺序为猪皮、大鼠皮、裸鼠皮。1贴剂设计为9h给药，而使用大鼠皮与裸鼠皮在9h已有超过70％的药物透过皮肤，对于处方优化的区分力度较差，所以选择最难透过的猪皮作为体外皮肤模型。裸鼠皮对1碱基的通透性是猪皮的3倍，与王鑫等对他克莫司体外经皮渗透性的考察结果一致[7]。

3.3考察了多种促透剂对1碱基透皮的促透作用，结果表明PG的促透效果最好，其次为OA和月桂氮酮。俞媛等对盐酸哌甲酯透皮特性的研究表明，5％PG与3％月桂氮酮联用的促透作用明显(P<0.05)[8]。后期需要考察促透剂联用对1碱基的促透效果。

作者：张成豪 罗华菲 林国钡 武余波 王浩 单位：中国医药工业研究总院药物制剂国家工程研究中心