薯蓣皂苷对大鼠心肌收缩力影响范文

《中国药理学通报杂志》2016年第一期

摘要：

目的观察薯蓣皂苷（dioscin，Dio）对大鼠心肌收缩力的影响。方法采用Langendorff逆行主动脉灌流法对大鼠离体心脏进行灌流，利用压力感受器插管法测定左心室相关心功能参数，记录低、中和高3个浓度Dio对左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压最大上升／下降速率（±dp／dtmax）的影响。利用激光共聚焦显微镜观察Dio对H9c2细胞内Ca2＋浓度的影响，并利用多功能酶标仪观察药物对细胞线粒体膜电位的影响。结果01、1μmol•L－1Dio可明显增加LVSP，由（1155±052），（1053±028）kPa分别增加至（1308±072），（1253±064）kPa（P＜001）；增加＋dp／dtmax由（038±010）、（040±007）kPa•ms－1分别增加至（042±011）、（043±002）kPa•ms－1（P＜005）。10μmol•L－1Dio则使LVSP由（1213±033）kPa减至（946±077）kPa（P＜001），使＋dp／dtmax由（042±004）kPa•ms－1降为（024±004）kPa•ms－1（P＜001）。01、1、10μmol•L－1的Dio可使H9c2细胞中Ca2＋相对荧光强度由（1662±089）分别增加至（2148±080）、（2568±069）和（1984±066）（P＜001）。01、1μmol•L－1Dio对H9c2细胞线粒体膜电位无明显影响，而10μmol•L－1Dio会使JC1单体与聚合物的比值由（114±003）增加为（135±006）（P＜001），即引起线粒体膜电位下降。结论低、中浓度Dio可增加LVSP和＋dp／dtmax，表现正性肌力作用，机制为增加细胞内Ca2＋浓度。并且，其在增加细胞内Ca2＋浓度的同时并不会引起钙超载，仅高浓度出现。

关键词：

薯蓣皂苷；Ca2＋浓度；正性肌力作用；离子通道；钠钙交换体；左心室收缩压

心力衰竭在临床上可分为急性心力衰竭和慢性心力衰竭［1］，严重时可导致意识模糊甚至昏迷，并最终产生心源性休克。同时，心衰所致的电生理重构往往造成心肌动作电位时程延长［2－4］，继而延长QT间期，这又会增加恶性心律失常发生的风险而诱发猝死等。故随着人们对其危害性的普遍认知，心衰的防治策略越来越受瞩目。目前，临床上心衰的治疗主要是应用地高辛、洋地黄毒苷等具有正性肌力作用的强心苷类药物［5］，但是其在增加心肌收缩力的同时易引起室早、室速等心律失常，且增加心脏的负担，而未能改善心衰患者的预后并降低其死亡率［6］。因此，探索更加安全有效的抗心衰药物仍是今后研究的难点与热点。

我们发现不少研究［7－10］证实，天然甾体皂苷薯蓣皂苷（dioscin，Dio）具有抗炎、抗肿瘤和抗骨质疏松等多种药理作用。本室前期实验研究亦发现Dio对乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤具有保护效应［11］，而且其在细胞水平可通过调节心肌钠、钙等离子通道而发挥抗缺氧／复氧诱导的心律失常作用。更为重要的是，我们前期研究还发现其具备一定的强心作用，且尚未见文献报道。因此，我们设想与强心苷类同属于甾体苷类的Dio产生的正性肌力作用是否与其相同？是否比其更低毒更安全？本实验将进行初步探索，以期揭示Dio作用特点和机制。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验对象健康、成年Wistar大鼠，♂，体质量250～300g，合格证号SCXK（京）20120004，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；大鼠心肌细胞H9c2细胞株，购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

1．1．2药品与试剂Dio购自国家天然药物研究中心；JC1和Fluo3AM钙离子荧光探针购自碧云天生物技术研究所。

1．1．3仪器GL2Langendorff灌流装置、BL420F生物机能实验系统，成都泰盟软件有限公司，中国；PHS3C酸度计，上海精密科学仪器有限公司，中国；Millipore纯水系统，美国；OLYMPUS全电动倒置荧光显微镜，日本；GeminiXPS荧光读板机，美国。

1．1．4液体的配制KH灌流液（mmol•L－1）：NaCl11806、KCl469、MgSO4118、CaCl225、NaHCO325、KH2PO4118、Glucose1111，预充混合氧（95％O2＋5％CO2）后调节pH至74。

1．2方法

1．2．1离体心脏Langendorff灌流法用25％乌拉坦麻醉大鼠，仰位固定于鼠台上，迅速剪开胸腔，暴露心脏，从主动脉根部离断取心脏，放入4℃生理盐水中去除脂肪及结缔组织。将主动脉逆行插管，以恒温（37℃）、充氧（95％O2＋5％CO2）的KH液8mL•min－1灌流，灌注压为8～9kPa左右。待心脏逐渐恢复跳动且残血排尽后，剪掉左心耳，将球囊压力感受器探头经左心房插入左心室。压力感受器经压力换能器与BL420生物机能实验系统相连以记录左心室收缩曲线，采样频率为800点•s－1。心脏灌流稳定30min，给药前5min作为空白对照，然后给予药物干预。给药后20min观察记录左心室各项心功能指标。

1．2．2细胞内钙离子浓度的测定以8×107•L－1的密度将细胞接种于共聚焦培养皿中，于孵箱中培养24h后，与药液共孵育20min。后加入Fluo3AM工作液负载30min，后用台氏液洗涤细胞3遍，向各组加入1mL台氏液，避光孵育20～30min。共聚焦显微镜下记录荧光信号，利用ImageJ软件计算胞内平均荧光强度。

1．2．3线粒体膜电位的测定以4～5×107•L－1的密度将细胞接种于24孔板，接种48h后用PBS冲洗2遍，给予相应含药培养基孵育20min。后用PBS冲洗1遍，换上终浓度15mg•L－1JC1孵育20min；孵育完成后，用PBS冲洗2遍，加入DMEM，放入酶标仪检测荧光值。

1．2．4实验分组①正常对照组；②低浓度01μmol•L－1Dio组；③中浓度1μmol•L－1Dio组；④高浓度10μmol•L－1Dio组。

1．2．5统计学分析数据以珋x±s表示，采用SPSS210软件进行配对t检验和单因素方差分析，方差齐时，多组间比较用LSD法；方差不齐时，采用DunnettT3法。

2结果

2．1Dio对大鼠离体心脏左心室各心功能指标的影响以给药前5min作为正常对照，采用配对t检验比较各组给药前后各心功能指标差异。由BL420系统记录到的左心室压力图像（Fig1）。01μmol•L－1和1μmol•L－1Dio使LVSP明显增加近13％和18％（P＜001）；＋dp／dtmax增加约11％和9％（P＜005），同时HR减慢；10μmol•L－1Dio则使LVEDP明显增加（P＜001），而LVSP等其他指标均明显降低（P＜001），且实验过程中偶见心律失常。各浓度Dio下参数具体变化见Fig2中给药后各参数与正常对照的比值。

2．2Dio对大鼠心肌细胞内钙离子浓度的影响Dio作用后Ca2＋荧光强度变化如Fig3和Fig4所示。与正常对照组相比，01、1和10μmol•L－1Dio均能使荧光强度增强（P＜001），其中1μmol•L－1Dio效应最明显，使荧光强度增加约5625％。

2．3Dio对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响Dio作用后荧光比值变化如Fig5所示。与正常对照组相比，01、1μmol•L－1Dio孵育均未引起荧光比值明显变化（P＞005）。但10μmol•L－1Dio使该比值增加约1842％（P＜001），显示该组线粒体膜电位降低。

3讨论

本实验分别探索了Dio对心肌收缩力和细胞内Ca2＋浓度的作用，低、中浓度Dio可使LVSP和＋dp／dtmax明显增加，体现正性肌力作用。研究证实，舒张性心力衰竭患者，左室射血分数正常而－dp／dtmax明显降低。Dio可增加－dp／dtmax，在一定程度上改善左心室舒张功能，相较于传统的正性肌力药更有优势。然而，高浓度Dio对心肌收缩力的作用却与低、中浓度相反，使LVSP和±dp／dtmax均减小，仅增加LVEDP。在实验过程中，在刚刚给予高浓度Dio时（5min内），可观察到LVSP有所增加，但随着灌流时间的延长，LVSP开始降低，甚至出现心律失常，这可能与高浓度Dio过分增加LVEDP，使得容量负荷过度有关。心肌收缩功能与细胞内Ca2＋水平密切相关［12－13］。我们由当前研究发现Dio的急性作用可使Ca2＋荧光强度增强，这表明Dio与洋地黄强心苷类药物作用方式相似，即通过增加心肌细胞内Ca2＋浓度而发挥正性肌力作用。这引发了我们对于Dio在提升细胞内Ca2＋水平的同时是否会导致钙超载，以及其诱导Ca2＋浓度增加的机制产生了思考。

首先，线粒体膜电位的测定结果显示，低、中浓度Dio对荧光比值无明显改变，即不由此引发细胞损伤。同时，其仅在10倍于中浓度的高浓度下才使该比值有一定升高，这与离体水平上高浓度的不良效果较为一致。但是与洋地黄毒苷类强心药易引发心律失常，增加心脏负荷相比，Dio似乎仍显示出更优的安全性，因为在1μmol•L－1浓度时，Dio增加细胞内Ca2＋浓度和心肌收缩力在本实验中最明显，而此时并未见心律失常以及钙超载所致的线粒体膜电位下降，显示出Dio在发挥正性肌力作用上可能具备一定优势。

其次，细胞内Ca2＋浓度的增加表明Dio并非如左西孟坦等钙增敏剂，通过增加心肌收缩蛋白对Ca2＋的敏感性来发挥强心作用［14］。另外，我们前期实验又证实Dio可减少L型Ca2＋通道介导的内向钙电流［15］，这表明L型Ca2＋通道不是Dio增加Ca2＋浓度的途径。因此，其机制有待于进一步研究。再有，我们前期结果还显示Dio能够增加内向钠电流［16］。联想到临床上使用的洋地黄类药物通过抑制心肌Na＋K＋ATP酶活性，使细胞内Na＋增多，从而通过钠钙交换体（sodiumcalciumexchanger，NCX）使细胞Ca2＋内流增加，产生正性肌力作用［17］。Flesch等［18］也认为，钠通道激活剂产生正性肌力作用的机制与钠钙交换活动增强有关。另外，进入细胞的Ca2＋也可触发肌浆网释放Ca2＋［19］。我们据此推测，Dio增强心肌收缩力的作用可能与影响钠钙交换体相关。因此，下一步我们将观察Dio是否通过上述机制增加胞内Ca2＋浓度以证明我们的设想。

总之，我们证实Dio通过增加胞内Ca2＋浓度产生正性肌力作用，还能改善舒张功能，仅高浓度时才产生一定的钙超载，基本符合理想正性肌力药的要求［20］。当然，本实验目前仅初步发现Dio的正性肌力作用，还尚未对其作用原理进行深入探究，故今后我们将从多途径，如NCX电流以及进出肌浆网的Ca2＋浓度变化等进行观察以阐明其机制。同时，Dio对病理情况下心肌收缩力的作用也亟待探索。

作者：韩钰 杨帆 丛恬鈔 孙凯 李燕 康毅 尹永强 娄建石 单位：天津医科大学基础医学院药理学教研室