马动脉炎病毒双抗体检测方法范文

《中国预防兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1病毒标准品的制备及检测抗体的标记将EAVBucyrus株接种于RK-13单层细胞，细胞病变(CPE)达80%以上时收获病毒，反复冻融3次，2000r/min离心30min，除去细胞碎片，收取上清液。上清液倍比稀释后接种于RK-13细胞，48h初步判定，72h最终判定，测得病毒上清液的毒价为10-5.5TCID50/100μL。将病毒上清液与0.5%TritonX-100混合，室温静置15min，12000r/min，4℃离心10min，上清液即为病毒标准品。辣根过氧化物酶标记的MAb2B3(HRP-2B3)由天津三箭生物技术公司标记，分装保存于-20℃。

1.2DAS-ELISA检测方法的建立

1.2.1操作程序利用pH7.6的PBS稀释纯化的MAb2B9包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，采用0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗板3次，每次3min；5%脱脂乳封闭酶标板，37℃2h，洗板；加病毒标准品和阴性对照(RK-13细胞上清液)，100μL/孔，37℃1h，洗板；HRP-2B3孵育酶标板，37℃1h，洗板；通过TMB使底物显色，100μL/孔，37℃10min；最后以2M浓硫酸50μL/孔终止反应，测定OD450nm值。

1.2.2最佳反应条件的选择在不同反应条件下，对捕获抗体包被量(8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL)，抗原的工作浓度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300)，HRP-2B3稀释度(1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000)，病毒标准品、捕获抗体、检测抗体(0.5h、1h、1.5h、2h)及TMB最佳作用时间(5min、10min、15min、20min)，封闭液的种类(10%BSA、5%小牛血清、5%脱脂奶粉)进行ELISA试验，检测同一阳性和阴性样品。选择阴性OD450nm值小于0.1，P/N值最大的条件为最佳条件。

1.2.3判定标准的确定取不同批次传代的RK-13细胞，收集上清液作为阴性样品，进行ELISA检测，同时设立阳性对照。计算被检RK-13细胞上清液的平均OD450nm值(X)和标准差(SD)，阳性临界值=阴性样品X+3SD。

1.2.4定量DAS-ELISA标准曲线的建立病毒标准品经1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀释，采用优化的DAS-ELISA方法进行试验，反应完毕测定OD450nm值。以TCID50值为横坐标，OD450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，确定相关系数和线性关系式。

1.3特异性检测应用建立的DAS-ELISA方法对实验室保存的EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4进行检测，确定该方法的特异性。

1.4敏感性检测病毒标准品以1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶100、1∶200、1∶300稀释，经DAS-ELISA方法检测，确定该方法的最低检出限。

1.5稳定性检测3次包被的酶标板重复检测不同TCID50的EAV细胞上清液，比较结果，评价该方法的稳定性。

2结果

2.1DAS-ELISA检测方法反应条件的优化以MAb2B9为捕获抗体包被酶标板，MAbHRP-2B3为检测抗体；通过方阵试验确定MAb2B9的最佳包被浓度为2μg/mL，最佳包被时间是4℃12h；MAbHRP-2B3的最佳工作浓度为2μg/mL，最佳反应时间为1h；抗原最佳工作时间为37℃1h；3种封闭液(10%BSA、5%小牛血清、5%脱脂奶粉)的封闭效果均比较理想，选用5%脱脂奶粉作为封闭液，37℃2h封闭效果最好；TMB显色最佳时间为10min(表1)。

2.2DAS-ELISA判定标准的确定采用20份不同批次传代的RK-13细胞上清液作为阴性样品，进行ELISA检测。经统计学处理，样品的X和SD值分别为0.0087和0.012，根据公式X+3SD计算，阳性结果判定标准的临界值为0.124，即OD450nm值≥0.124判为阳性。

2.3定量DAS-ELISA标准曲线抗原的TCID50值和其经DAS-ELISA检测的OD450nm值之间呈线性关系，线性方程为y=5×10-5x+0.0651，R2为0.9982(图1)。

2.4特异性试验以DAS-ELISA方法检测EAV、EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4，仅EAV的检测值OD450nm>0.124(图2)，表明该方法在检测其他病毒时无交叉反应，特异性好。

2.5敏感性试验病毒标准品以PBS做1∶5～1∶300稀释，应用建立的ELISA方法对其进行检测。1∶200稀释时，OD450nm值为0.131>0.124，1∶300稀释时，OD450nm值为0.096<0.124，表明该方法的最低检出限为1∶200(103.2TCID50)。2.6稳定性试验3块不同的酶标板(1、2、3)对倍比稀释的病毒标准品的检测重复性良好，并且呈线性分布，表明该方法的稳定性好。

3讨论

虽然近年来我国尚未有分离到EAV的报道，但赛马业的迅速发展，马匹交流的频繁，增加了EVA的传播风险。OIE指定用于国际贸易中检测EAV的方法是VN[11]。VN应用于确诊可疑马，筛选种公马是否感染EAV，具有良好的特异性和较高的敏感性，但该方法操作复杂，耗时长，不易于大批量样品的检测。现有的ELISA方法中，MAb阻断ELISA方法操作简单，成本较低，但病毒抗原的制备较为复杂，很难保证批次的稳定性。本实验建立的DAS-ELISA方法能够特异性地检测EAV，与EIAV、EIV、EHV-1和EHV-4呈现明显的阴性反应，操作简单、试验周期短，可以同时检测大批样本。并且该DAS-ELISA方法具备极好的稳定性，包被的酶标板在-20℃冰箱保存一个月，其敏感性和特异性均未变。由于临床样本中未发现感染EVA的病例以及马匹动物实验实施的不便，无法开展该方法和其他方法的比较试验，但实验室阶段的研究工作已经成熟，为后期诊断试剂盒的开发提供良好的实验基础。该方法对口岸及养马场中马匹的快速检测、疫情的发现和控制具有十分重要的意义。

作者：胡月戚亭赵世华关平原王晓钧单位：内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病与慢病毒创新团队