猪瘟病毒在哺乳动物细胞中的表达范文

《中国预防兽医学报》2014年第八期

1材料和方法

1.1重组杆状病毒制备将pFastBac-G-VP73转化含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选及划线培养、纯化阳性菌落，经PCR鉴定后获得重组杆粒Bacmid-G-VP73。利用脂质体介导转染法，将Bacmid-G-VP73转染到Sf9昆虫细胞中，于28℃培养，待出现细胞病变后，收集细胞培养上清液即含有重组杆状病毒。

1.2重组杆状病毒感染BHK-21细胞将重组杆状病毒液加入细胞培养板中生长至60%的BHK-21细胞单层中，28℃感染4h，更换培养基，37℃培养48h。1.6Westernblot检测目的蛋白的表达收集重组杆状病毒感染48h后的BHK-21细胞，裂解后12000r/min离心5min，收集上清液，以VP73MAb为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗进行westernblot鉴定。

2结果与讨论

2.1重组真核表达质粒pcDNA-VP73的构建以含有VP73全基因的重组质粒为模板，采用引物P1/P2进行PCR扩增，检测结果表明，PCR产物片段约为1200bp。纯化的扩增产物经双酶切回收后，克隆于pcDNA3.1中构建重组质粒pcDNA-VP73。经测序结果表明VP73基因为1188bp，与预期结果一致。

2.2重组穿梭载体(Bacmid-G-VP73)的构建以pcDNA-VP73为模板，采用引物P3/P4PCR扩增回收CMV-VP73并克隆于pFastBac-VSV/G中，构建重组转移质粒pFastBac-G-VP73，经酶切鉴定及测序结果鉴定正确，继而转化DH10Bac大肠杆菌，大肠杆菌Bacmid中LacZ基因由于CMV-VP73表达盒的插入而失活从而筛选纯化重组穿梭载体Bacmid-G-VP73。分别提取重组杆状病毒与野生型病毒BacmidDNA，利用VP73基因上游引物P1和M13下游引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示Bacmid-G-VP73PCR产物大小约1800bp，而野生型病毒Bacmid对照无扩增条带，与预期结果一致，表明CMV-VP73已经整合重组到杆状病毒的Bacmid中。

2.3重组杆状病毒AcNPV-G-VP73的制备利用脂质体介导的转染法，将新鲜提取的重组穿梭载体BacmidDNA转染Sf9昆虫细胞，28℃培养72h，收取上清液即含有重组杆状病毒AcNPV-G-VP73。我国以杆状病毒为载体在其受纳的昆虫细胞中对ASFV蛋白真核表达的研究已有报道[6-7]，但利用杆状病毒对ASFV蛋白在哺乳动物细胞中的真核表达却鲜有报道。本研究中CMV-IE启动子启动VP73基因在哺乳动物细胞中表达，限制其在常规杆状病毒受纳的昆虫细胞中表达，同时利用VSV/G蛋白膜融合的活性避免病毒基因组被哺乳动物细胞内的补体灭活，病毒培养达到较高的滴度时，Sf9细胞即出现明显的融合现象。

2.4重组杆状病毒AcNPV-G-VP73介导VP73基因在哺乳动物细胞中的表达将重组病毒AcNPV-G-VP73以100MOI感染BHK-21细胞，48h后收集细胞蛋白，westernblot分析，该蛋白能够与抗VP73的特异性MAb反应，出现一条约为45ku的目的蛋白带，而正常BHK-21细胞和以相同感染复数AcN-PV-G-EGFP感染的BHK-21的细胞裂解蛋白均无此特异性条带(图2)，结果表明VP73蛋白在哺乳动物细胞中得到了表达，特异性较强。鉴于目前国内外尚无有效的疫苗用于ASF防控，而且在国内禁止引进外来病毒，无法建立该病的血清学检测技术的情况下，本研究所构建的以杆状病毒为载体的疫苗对于预防未来可能发生的ASF具有明显的现实意义。综上所述，本研究开展了ASF的相关储备性研究，构建了能够在哺乳动物细胞中表达ASFVVP73蛋白的重组杆状病毒，为ASF疫苗的研究及检测方法的建立奠定了基础。

作者：靳雯雯杨晓红朱碧波吕建强曹胜波单位：华中农业大学动物医学院深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心