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妥曲珠利微晶体的制备范文

时间:2022-08-28 12:05:31

妥曲珠利微晶体的制备

《中国兽医学报》2014年第七期

1材料与方法

1.1Tol微晶体的制备称取0.3g纤维素衍生物溶解于100mL蒸馏水中,4℃条件下溶胀过夜,备用。称取Tol1g溶解于20mL乙腈中,纤维素衍生物溶液置于冰水浴中,不断搅拌条件下,将Tol乙腈溶液缓慢加入100mL纤维素衍生物溶液中,待完全加入后立即过滤得到沉淀,真空干燥研磨后得Tol微晶体。

1.2Tol微晶体显微形态将Tol微晶体和Tol分别分散于载玻片上,置于生物显微镜下观察其形态特征。

1.3Tol微晶体体外溶出速率分别称取0.5g的Tol微晶体和Tol原药,分置于100mL容量瓶中,蒸馏水定容,25℃水浴中连续振荡,分别于5、10、15、20、30、40、50、60、90、120min时取样1mL,再补充1mL蒸馏水(25℃),取出的1mL样品用0.22μm的滤膜过滤,取20μL于高效液相色谱仪测出峰面积,代入标准曲线方程(S=42921C+5639,R2=0.9996)计算出溶液中Tol浓度。

1.4血浆中Tol含量测定方法的建立

1.4.1色谱条件色谱柱为KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈∶0.1%乙酸溶液(55∶45),流速为1.0mL/min;柱温为25℃;紫外检测波长为240nm;进样量为20μL。

1.4.2血样处理准确吸取0.2mL血浆样品于1.5mL的离心管中,加入0.3mL乙腈,涡旋混合器混合1min,12000r/min离心10min,吸取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤,取滤液20μL作HPlC分析。

1.4.3方法专属性按照1.7.2的方法处理空白血浆、空白血浆加入Tol样品及家兔口服Tol和微晶体后的血浆样品,比较色谱图的差异。

1.4.4标准曲线和最低检测限精密称取20.0mgTol原药,置于50mL容量瓶中,加入甲醇溶解后定容,配置成400mg/L的Tol储备液。吸取一定量的Tol储备液用甲醇配置成2.0、4.0、8.0、16、32、64、128、256mg/LTol对照液。取0.18mL空白血浆,加入各浓度的Tol对照液0.02mL,使血浆中的Tol的质量浓度为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、19.2、25.6mg/L。按照1.7.2的血浆处理方法处理,进样20μL分析。以血浆中Tol浓度(C)为横坐标,以峰面积(S)为纵坐标,做出标准曲线,得到回归方程和相关系数。用空白血浆制成低溶度的药物样品,经处理后测定,将引起3倍基线噪音的药物质量浓度定义为最低检测限。

1.4.5精密度和回收率试验取空白血浆0.18mL,加入0.02mL不同质量浓度的Tol对照液配置成0.8、3.2、25.6mg/L高、中、低3个质量浓度的血浆样品5份,并按照1.7.2的血浆处理方法处理。取同一高、中、低样品一日内测定5次,连续测定5日,计算出日内和日间精密度。测定高、中、低5份样品,以标准曲线测得量与Tol加入量的比值计算回收率。

1.5Tol与微晶体的药代动力学参数测定

1.5.1给药及血样采集家兔在试验前用不含药物的家兔专用饲料饲养10d,给药前禁食12h,随机分为2组。将Tol和微晶体分别加入适量的蒸馏水制成混悬液,一次性给家兔灌胃,给药剂量均为10mg/kg。于给药前及给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48h和3、5、7、10d,分别从各只家兔耳缘静脉采血,采血量为1mL,肝素钠抗凝,4000r/min离心取上层血浆,置于-20℃冰箱中备用。

1.5.2样品测定及数据处理按1.7.2项的方法,测定各血浆样品中Tol含量。所得数据用DAS2.0药动学软件处理,进行各种药代动力学模型拟合,计算各自数据的药代动力学参数;用SPSS(19.0)分析血药浓度和相关药代动力学参数的差异性。

2结果

2.1Tol微晶体显微形态Tol微晶体及原药的显微形态特征见图1。Tol原药呈10~30μm不等的针状晶体;将Tol制成微晶体之后,晶体大小明显减小,呈2~5μm不等的不规则晶体。

2.2Tol微晶体体外溶出速率Tol及微晶体的体外溶出速率见图2。由图可知,微晶体的溶出速度大于Tol原药,说明Tol制成微晶体后,由于粒径减小,其溶出速率得到明显改善。

2.3方法专属性色谱图在选定的色谱条件下,色谱图见图3。由图可知,羟丙基-β-环糊精对药物测定无干扰,血浆中内源性物质与Tol分离良好,Tol的保留时间在7.8min左右。

2.4标准曲线和线性范围按照1.7.4的方法得标准曲线方程为S=16626C+19394,R2=0.9996,表明血浆中的Tol质量浓度在0.2~25.6mg/L范围内线性关系良好,最低检测限为0.05mg/L。

2.5精密度和回收率试验精密度和回收率试验结果见表1。

2.6Tol及其微晶体在家兔体内的药代动力学结果家兔灌胃给与Tol和微晶体后药时曲线见图4,数据采用DAS2.0药代动力学软件进行模型拟合,以AIC值最小,R2值最大为判断依据,结果符合一级吸收二室模型,其模拟方程分别为C(TOl)=20.296e-0.038t+4.524e-0.015t-23.439e-0.067t;C(微晶体)=32.925e-0.089t+3.167e-0.015t-29.485e-0.082t。具体药代动力学参数的比较见表2,Tol和Tol微晶体的Cmax分别为(8.925±0.360)mg/L和(12.510±0.525)mg/L,tmax均为24h,AUC(0-∞)分别为(411.605±20.918)mg/L•h和(578.650±11.664)mg/L•h,Tol微晶体相对生物利用度为140.6%。

3讨论

3.1Tol微晶体显微特征及体外溶出微细化的药物晶体可达几微米至几纳米,可以明显增加药物的溶出速率和在机体内的生物利用度,且无需载体材料,是近十几年的药剂学研究热点[8]。微晶体的制备方法有沉淀法、高压均质法、喷雾干燥法、蒸发沉淀法、乳化法、超临界流体结晶法等[9-11],其中反溶剂沉淀法以操作简单、成本低、制得粒子粒径小分布窄等优势,受到广泛的运用。Douroumis等[12]用沉淀法制备了卡马西平纳米晶体,明显增加了卡马西平的溶出速率。张智亮等[13]采用高压均质技术将伊曲康唑制成超细晶体颗粒,溶出速率提高了13倍。现在西罗莫司、阿瑞吡坦、非诺贝特等多种采用晶体微粒化技术生产的新药在美国已经上市[10]。本试验采用反溶剂法制备Tol微晶体,由于反溶剂中有大量高分子材料吸附在晶体表面,与Tol形成氢键,且不断地搅拌,阻碍了晶体的生长,使晶体大小明显小于Tol原药[12]。体外溶出速率试验中,由于微晶体晶体大小较原药明显减小,使得溶出速率增加,此外,制备微晶体中有少量的高分子材料附着在微晶体表面,增加了晶体表面的亲水性,使得溶出速率进一步增加。但是由于晶体类型并没有改变,其溶解度并没有明显的差异,试验结果与祁雯雯等[4]报道相近。

3.2血浆样品的处理据报道,采用二甲基亚砜和乙腈联合处理血浆样品萃取效率较高,但是由于二甲基亚砜有较强的紫外吸收,使得溶剂峰较高,且有一定的拖尾,影响到药物峰检测[14]。根据文献[15-16]报道和试验验证,本试验采用乙腈沉淀蛋白法测定血浆中的Tol方法操作简单,专属性强,精密度高,溶剂峰较低,不影响药物的测定,平均萃取回收率达90%以上,符合生物供试品分析要求。

3.3药代动力学分析从药代动力学参数可知,Tol和微晶体在家兔体内均属于一级吸收二室模型,与国内外文献[16-18]报道Tol在多种动物体内药动学模型相同。吸收速率常速(Ka),达峰时间(tmax)、达峰浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUC)是衡量药物吸收速率和程度的重要参数,因此比较了原药和微晶体的Ka、tmax、Cmax、AUC(0-∞)的差异性,其中Ka、Cmax、AUC(0-∞)差异极显著。由于Tol在体内的代谢时间较长,增加吸收速率是增加其生物利用度的关键。从药动学参数来看,原药的吸收速率为(0.067±0.007)/h,而微晶体的吸收速率增加到了(0.082±0.005)/h。由于微晶体只是改变了晶体的大小,并未改变晶体类型,故达峰时间与原药均为24h,与Kim等[18]的结果相近。但是由于晶体粒径减小和表面亲水性的增加,使药物更容易溶出,微晶体的达峰浓度(12.510±0.525)mg/L较原药达峰质量浓度(8.925±0.360)mg/L明显增加。原药和微晶体AUC(0-∞)分别为(411.605±20.918)mg/(L•h)和(578.650±11.664)mg/(L•h),计算得相对生物利用度为140.6%,Tol制成微晶体后在家兔体内的生物利用度有很大的提高。高缘等[19]将黄芩素制成纳米混悬液,并研究了其在大鼠体内的药动学特征,结果表明黄芩素纳米混悬液明显的提高黄芩素的生物利用度,与本试验的结论相符,说明药物制成微晶体后能有效的提高其生物利用度。

作者:卢朝成符华林张伟金超周涛刘梦娇张艳丽曹航罗莉单位:四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室

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