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猫钩虫PCR检测方法范文

时间:2022-08-28 11:55:13

猫钩虫PCR检测方法

《中国兽医科学杂志》2014年第八期

1材料与方法

1.1粪样和对照样品本研究所用的112份流浪猫粪样采自广州市某宠物救助站。阳性对照样品巴西钩虫为美国诺华动物保健有限公司StephenEBienhoff博士赠送。阳性对照样品犬钩虫和锡兰钩虫以及阴性对照样品猫弓首蛔虫、犬复孔绦虫、狐毛尾线虫虫卵,蓝氏贾第虫包囊、猫等孢球虫卵囊均为华南农业大学寄生虫病教研室保存。

1.2主要试剂粪便DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品。UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体及JM109感受态细胞均为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.3显微镜检查在待检的猫粪样品中加入2倍体积的蒸馏水搅匀,0.246mm的筛网过滤1次,吸取1~2mL过滤液于5mL离心管中,加入2倍体积蒸馏水,4000r/min离心5min,弃上清液,加入2.5mL33.3g/L的硫酸锌溶液,搅匀,1500r/min离心3min,再加入33.3g/L的硫酸锌溶液直至加满离心管,其上放置一盖玻片,静置5min后,移开盖玻片,放置于载玻片上,卢戈氏碘液染色,在40×10倍镜下检查。

1.4粪便DNA的提取吸取1.3中的粪便过滤液1.5mL于2mL离心管中,4000r/min离心5min,弃上清液,加入适量的玻璃珠并在-80℃和100℃中反复冻融5次,然后加入适量的缓冲液和蛋白酶K,漩涡振荡30min,55℃消化16h。之后,按照粪便DNA提取试剂盒使用说明书提取虫卵基因组DNA。

1.5PCR反应条件的优化扩增引物为钩虫ITS部分序列的保守引物AF:5′-CTTTGTCGGGAAGGTTGG-3′和AR:5′-TTCACCACTCTAAGCGTCT-3′[12],预期扩增片段的大小为404bp。PCR反应体系(25μL)为:10×Buffer2.5μL,dNTP5nmol,上、下游引物各25pmol,ddH2O17.3μL,模板2μL,ExTaqDNA聚合酶0.2U。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,51.9~69.5℃退火30s,72℃延伸45s,35个循环;72℃后延伸7min。根据不同退火温度下目的条带的亮度确定最佳退火温度。

1.6特异性试验按照1.5中的最佳退火温度,分别取锡兰钩虫、犬钩虫、巴西钩虫和阴性对照的基因组DNA2μL作为模板,同时设立灭菌双蒸水作为空白对照进行PCR扩增,重复2次,检测该方法的特异性。

1.7敏感性试验测定提取的钩虫虫卵基因组DNA浓度,然后按10倍倍比连续稀释,每个倍数稀释样品取2μL作为模板进行PCR扩增,重复2次,检测该方法的敏感度。

1.8PCR方法的临床检测对112份流浪猫粪样进行3次碘液染色镜检,同时提取粪便DNA进行PCR检测,比较两种方法的检出率。以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准,按照诊断试验真实性评价方法计算PCR方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。计算方法如下:敏感度=真阳性/(真阳性+假阴性);特异度=真阴性/(假阳性+真阴性);阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性);阴性预测值=真阴性/(假阴性+真阴性)。PCR扩增后,随机抽取5个阳性样品进行切胶并按照胶回收试剂盒说明书回收纯化PCR产物,将纯化产物连接到pMD18-T载体上,连接之后的载体转入JM109感受态细胞中,然后将连接产物均匀涂布于含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的固体营养琼脂培养基上,37℃培养过夜后挑取单个菌落,37℃摇床培养6h,菌液PCR鉴定,将含有目的片段的菌液送至北京华大生物技术有限公司测序。

2结果

2.1PCR最佳退火温度的筛选温度梯度PCR扩增的电泳结果显示,退火温度为61.2℃时扩增效果最好(见图1)。

2.2特异性试验特异性PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,只有钩虫的基因组DNA样品扩增出404bp的条带(见图2)。

2.3敏感性试验经核酸测定仪测定,钩虫虫卵基因组DNA的质量浓度为107.2μg/mL。重复试验显示,该反应体系的最低检测限为1∶108的稀释度,即最低可检测1.07fg钩虫虫卵基因组DNA(见图3)。

2.4临床初步应用两种方法的检测结果显示,镜检法第1次的检出率为34.8%,3次的检出率为43.8%;PCR方法一次的检出率为43.8%(见表1)。以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准,根据公式计算,得出该PCR检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均为100%。测序结果显示,5个随机样品的序列长度均为404bp,同源性比对发现,1个序列(登录号:KJ840829)与GenBank中收录的1株锡兰钩虫ITS序列(登录号:KF279136)的一致性为99%,另外4个序列(登录号:KJ840825~KJ840828)与1株犬钩虫ITS序列(登录号:KC755025)的一致性均为99%。

3讨论

猫钩虫是一种土源性寄生虫,其感染性幼虫在适宜的外界环境中可存活数周,污染环境,造成宿主反复感染,对犬猫和人类的健康构成潜在威胁。目前大多采取化学防治的防控措施,但药物治疗对钩虫的再次感染影响甚微,并且长期的药物驱虫使得轻度感染越来越普遍,造成粪便镜检的漏检率升高。采用重复粪便镜检虽然可以提高检出率,但费时费力,特别是对于大规模的钩虫病流行病学调查时,过长的镜检还会引起粪便中虫卵的变形或溶解。因此,急需建立一种适合临床使用的钩虫敏感、特异、快速的检测方法。内转录间隔区(internaltranscribedspacers,ITS)是介于核糖体18S、5.8S和28SDNA之间的区域。多项研究表明,ITS序列可以作为钩虫的分子标记与其他寄生虫进行区分。因此,本研究根据钩虫ITS部分序列的保守引物建立了猫钩虫的PCR检测方法。特异性试验中只有猫钩虫扩增出目的条带,猫的其他常见寄生虫没有扩增产物出现。

在敏感性试验中,最低检测到1.07fg钩虫基因组DNA。上述结果表明该方法具有较高的特异性和敏感性。在对112份临床猫粪的检测中,PCR方法的检出率比首次粪便镜检高9%,而与重复3次的镜检结果一致。近年来,越来越多的PCR检测技术已应用于人钩虫病的诊断,显示了较高的敏感性和特异性。Schr等比较了粪便镜检法和PCR方法对人体钩虫的检出率,结果PCR方法的检出率比粪便镜检法高11%。Wang等应用粪便镜检法和两种PCR方法同时对人粪便中的美洲钩虫进行检测,结果显示两种PCR方法均较粪便镜检法敏感。本试验中,以3次镜检作为猫钩虫病诊断的金标准时,PCR方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均达到了100%。5个随机样品的测序结果显示序列长度均为404bp,同源性比对发现5个序列与GenBank中收录的锡兰钩虫和犬钩虫的ITS序列一致性达99%,说明扩增结果正确。另外,该方法运用试剂盒,仅对粪便进行简单处理即可快速简便地提取粪便中的钩虫虫卵DNA,提高了检测效率。临床初步应用结果说明,该方法适用于钩虫病的流行病学调查和临床诊断。

作者:胡伟刘远佳郑国超谭立娉罗琴李国清单位:华南农业大学兽医学院

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