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壁虎醇提物抑制C6的增殖范文

时间:2022-12-25 08:33:40

壁虎醇提物抑制C6的增殖

《中国临床药理学杂志》2015年第二十二期

神经胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,发生于神经外胚层,具有发病率高、治愈率低、复发率高及病死率高等特点,药物、放射和手术等组成的综合治疗方案是目前的主要治疗方法。常规的化疗药具有严重的不良反应,并且易有耐药现象的发生,导致其疗效和应用受到了限制[1]。本实验研究壁虎醇提物(Gekkoethanolextract,GEE)对C6细胞的抗肿瘤活性,并对GEE抗肿瘤的机制进行初步探索。

一、材料与方法

1材料

细胞胶质瘤C6细胞株,由中国药科大学惠赠。药品与试剂多疣壁虎,批号:090301,安徽永刚饮片公司生产;5-氟尿嘧啶,批号:FA131008,规格:每支10mL/0.25g,上海海普药业生产生产。DMEM干粉,美国Gibco公司生产;胰酶、四甲基偶氮唑盐及Hoechst33258,均美国Sigma公司生产;PVDF膜,美国PALL公司生产;AIF一抗,北京博奥森公司生产;β-actin、caspase-9一抗,北京中杉金桥公司生产。仪器SK3c细胞培养箱,日本Sanyo公司产品;JM-L研磨机,上海诺尼轻工机械有限公司产品;BX41荧光显微镜,日本Olympus公司产品;Minitrans-blot电转膜系统,美国Bio-Rad公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养用含10%胎牛血清的培养液在37℃、5%CO2条件下培养,以0.25%胰蛋白酶消化、传代,并进行实验。

2.2GEE的制备双蒸水400mL与壁虎干粉100g混匀后,研磨4h,离心取沉淀。用55%乙醇溶液醇沉4h后,离心,取上清,进行旋转蒸发去除乙醇,冻干得GEE干粉,贮于-20℃冰箱备用。

2.3MTT法检测GEE抑制C6细胞生长实验将C6细胞(5×104mL-1)200μL接种到96孔板,设5个复孔。培养24h后,实验组加入浓度分别为0.1,0.15,0.2,0.3,0.4mg•mL-1GEE的培养液,并设对照组(0.01mg•mL-15-氟尿嘧啶)和空白组,分别处理20,44,68h后,每孔加MTT溶液20μL。继续培养4h后,每孔加DMSO200μL,振荡混匀后,测定光密度(A490)值,计算抑制率。

2.4观察细胞形态改变以5×104mL-1的细胞浓度接种6孔板,培养24h后给药。设置空白组、对照组(0.01mg•mL-15-氟尿嘧啶)和实验组(0.1,0.2,0.4,0.6mg•mL-1GEE),作用24h后,在倒置显微镜下观察C6细胞形态的改变。

2.5Hoechst33258荧光染色取C6细胞2mL,接种于铺有盖玻片的6孔板内,细胞贴壁后,分组给药(同2.4),继续培养24h后,用4%多聚甲醛37℃固定10min,置于Hoechst33258染色液中,避光孵育10min。PBS冲洗后,取出盖玻片,观察并拍照。

2.6Westernblot法检测caspase-9与AIF蛋白的表达将C6细胞接种于6孔板中,分别设置空白组、实验组和对照组。空白组不加药,实验组分别加0.1,0.2,0.3mg•mL-1GEE培养液,对照组给予0.01mg•mL-15-氟尿嘧啶培养液,继续培养48h后提蛋白,进行变性PAGE电泳。AIF(1∶500)、caspase-9(1∶500)及β-actin(1∶1000)在4℃孵育过夜,羊抗鼠二抗(1∶1000)室温下震荡孵育1h,DAB显色后观察并分析结果。

3统计学处理结果数据以x珋±s表示,采用SPSS16.0进行统计处理,用单因素方差分析进行样本均数的比较。

二、结果

1GEE对C6细胞增殖的抑制作用药物作用于细胞24,48,72h后,GEE对C6细胞增殖有抑制作用,可见随时间的延长和药物浓度的增加,细胞抑制作用逐渐增强,呈剂量和时间依赖性。实验组与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

2细胞形态改变的观察及其改变倒置显微镜下观察,空白组,细胞大小均一,呈梭形,相互连接成网状。实验组,突起减少,细胞变圆,贴壁的细胞数量明显减少,细胞的胞浆可见空泡变性,胞质内的颗粒增多,形成大量的细胞碎片。荧光显微镜下观察,空白组,细胞核形态较好,呈椭圆形或圆形,可见均匀的蓝色荧光。对照组和实验组,细胞可见典型的凋亡形态学改变,表现为胞核缩小,大小不一,形态不规则,并有致密的强荧光团块,见图1。

3GEE对C6细胞caspase-9、AIF蛋白表达的影响不同浓度的GEE可诱导caspase-9、AIF蛋白的表达,且有不同程度的升高,与空白组比较差异有显著统计学意义(P<0.01),见图2。

三、讨论

前文研究发现,壁虎醇提物可以抑制移植于鼠肾包膜下的H22肝癌瘤块的生长,并且在体外可诱导人喉癌Hep2细胞凋亡。本实验研究发现,GEE能够抑制C6细胞的增殖及诱导细胞凋亡。本研究表明,caspase-9和AIF蛋白的表达量与GEE的药物浓度呈正相关,提示GEE可能通过增加caspase-9和AIF蛋白的表达水平,进而促进C6细胞的凋亡。GEE对C6细胞的增殖有明显的抑制作用,并诱导C6细胞凋亡,其机制可能与caspase-9和AIF蛋白表达水平上调相关。但GEE成分比较复杂,有待进一步研究。

作者:葛文静 王建刚 靳颖 李瑞芳 段冷昕 刘玲 单位:河南科技大学 医学院 药理学与分子生物学实验室

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