人循环纤维细胞中的表达及功能范文

《中国病理生理杂志》2016年第四期

［摘要］

目的:研究钙库操纵性钙通道(store-operatedcalciumchannels，SOCC)相关功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2在人循环纤维细胞中的表达及SOCC对人循环纤维细胞分化的影响。方法:采集健康人外周静脉血，分离出单个核细胞，体外培养分化为循环纤维细胞。采用RT-PCR和real-timePCR检测循环纤维细胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表达情况，并检测SOCC抑制剂对循环纤维细胞分化的影响。结果:Real-timePCR检测结果显示ORAI1-3和STIM1-2mRNA在循环纤维细胞中有较高的表达水平，并且SOCC抑制剂SKF-96365对循环纤维细胞分化具有明显的抑制作用。结论:SOCC表达于循环纤维细胞中，并且影响循环纤维细胞的分化。

［关键词］

循环纤维细胞;钙库操纵性钙通道;ORAI1-3;STIM1-2

人循环纤维细胞是外周循环中的一种骨髓来源的间充质祖细胞［1］，由CD14+单核细胞分化而来［2］，主要参与组织的修复与纤维化的过程，除此之外，还能作为抗原递呈细胞激活T淋巴细胞［3］、促进血管生成［4］和稳定细胞外基质［5］。在健康个体中，它占有核细胞的比例不到1%［6］。近年来，大量研究证实循环纤维细胞是肌成纤维细胞的前体［7］，能够迁移并在肺中募集，可能通过促进平滑肌层增厚［8］、促纤维化和/或促进炎症过程［3］、促进新血管生成［4］和重建细胞外基质［5］等途径参与慢性哮喘气道重塑过程。钙信号是细胞的重要第二信使，参与了细胞的增殖、分化、迁移和细胞因子分泌等多种功能的调控。细胞内钙离子浓度升高主要通过肌浆网/内质网等钙库中的内钙释放和胞外钙离子内流两种途径实现［9］。细胞膜上钙库操纵性钙通道介导的钙库操纵性钙内流是非兴奋性细胞外钙内流的主要途径［10］。目前发现ORAI家族蛋白ORAI1-3主要参与SOCC的钙内流孔道的构成，而STIM家族蛋白STIM1-2主要作为胞内钙库钙离子浓度的“传感器”，在钙离子浓度下降时将这一信号传递到胞膜的SOCC，促使其开放，介导钙离子内流。本研究应用real-timePCR检测了体外培养的人循环纤维细胞中SOCC相关功能蛋白ORAI1-3和STIM1-2表达情况，并初步探讨SOCC抑制剂对循环纤维细胞分化成熟的影响，为将来深入探讨它们在支气管哮喘病理机制中的功能奠定基础。

一、材料和方法

1主要试剂RPMI-1640培养基、1mmol/LHEPES、100×非必须氨基酸、100mmol/L丙酮酸钠和100×ITS-3均购自Sigma;青霉素(1×107U/L)/链霉素(10g/L)混合液(100×)和200mmol/L谷氨酰胺购自Hy-Clone;平底24孔组织培养板购自BDBiosciences;人CD14+单核细胞负选磁珠购自DynalBiotech;TRITC连接的鼠抗人CD45和I型胶原(collagenⅠ，ColⅠ)抗体、驴抗兔IgGH＆L(FITC)II抗及SKF-96365购自Abcam;TRIzol、DNA处理酶I和逆转录酶SSⅢ购自Invitrogen;高保真Taq酶和SYBRPremixExTaqTM购自TaKaRa。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根据设计合成。

2主要方法

2.1人循环纤维细胞的分离及培养用肝素抗凝管采集每位健康志愿者(来自武汉大学医学院，均签署书面知情同意书)外周血50mL，用pH7.4无菌磷酸盐缓冲液(PBS)等体积稀释后，用等体积的淋巴细胞分离液分离，2000r/min离心20min，小心吸取白膜。用至少3倍体积的无菌PBS洗涤白膜，1500r/min离心15min，轻轻吸除上清。分离所得的细胞即为外周血单个核细胞。加500μL隔离缓冲液(0.1%BSA和2mmol/LEDTA的无Ca2+及Mg2+的PBS)轻轻混匀细胞，用DynabeadsUntouchedTM人单核细胞磁珠负选试剂盒得CD14+单核细胞。用无血清的RPMI-1640完全培养基［含10mmol/LHEPES，2mmol/L谷氨酰胺，1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2%BSA，1×ITS-3(5mg/L胰岛素，5mg/L转铁蛋白，5μg/L亚硒酸钠)，1mmol/L丙酮酸钠，1×非必需氨基酸］1mL重悬细胞，吹打混匀。将所得的细胞按2.5×109/L的密度接种于24孔培养板内，每孔2mL，然后将培养板置于含5%CO2的细胞培养箱内37℃培养7d，观察细胞形态变化。

2.2人循环纤维细胞的鉴定(1)形态学鉴定:按上述方法培养7d后，光镜下观察，呈纺锤状的长梭形贴壁细胞即为循环纤维细胞。(2)免疫组织化学鉴定:将分离的细胞接种于共聚焦培养皿内，置于37℃，含5%CO2的细胞培养箱内培养7d，然后选择分化较好的细胞培养皿，弃培养基，PBS洗涤细胞3次，加入TRITC连接的CD45抗体，4℃孵育30min后，细胞清洗3次。用250μL的固定破膜剂重悬细胞，4℃固定破膜20min。加入PBS溶液2mL，轻轻晃动培养皿，洗涤细胞3次，用含2%牛血清白蛋白的PBS室温封闭60min。加ColⅠ的I抗，4℃过夜。再用2mLPBS清洗细胞3次后，加入FITC标记的驴抗兔IgG的II抗，4℃暗室孵育，过夜。2mLPBS清洗细胞3次后，加入PBS，荧光显微镜下观察CD45和ColI的表达情况。

2.3RT-PCR及Real-timePCR检测循环纤维细胞中ORAI1-3及STIM1-2的mRNA表达情况将分离得到的CD14+单核细胞按2.5×108/L的密度接种到24孔培养板培养7d。取样后每管加入1mLTRIzol进行RNA抽提，最后每管RNA晾干后加40μL灭菌0.1‰DEPC处理双蒸水溶解RNA沉淀。取2μg总RNA至1.5mL离心管中进行反转录，所使用DNaseI和逆转录酶SSⅢ均来自Invitrogen，反转录完成后生产的cDNA产物补双蒸水至50μL。RT-PCR检测采用的反应体系为:0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，2μLdNTPs(2.5mmol/L)，2μL10倍缓冲液，0.2μLExTaq，2μL反转录cDNA产物为模板，最后补灭菌双蒸水至20μL;反应条件为:为94°C5min;94°C15s，60°C30s，72°C30s，共28循环;72°C5min。反应完成后PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。Real-timePCR检测基因表达量采用的反应体系是10μLSYBRPremixExTaqTM，0.4μLprimerF/R(10μmol/L)，0.4μLROXReferenceDyeⅡ(10μmol/L)，2μL反转录cDNA产物，最后补灭菌双蒸水至20μL。Real-timePCR反应程序为:94°C10s;94°C5s，60°C38s，40循环;95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。RT-PCR以及real-timePCR所用引物见表1。

2.4SOCC抑制剂对循环纤维细胞分化的影响将分离得到的PBMCs按2.5×108/L的密度接种到24孔板内;分组情况如下:分别设置空白对照组和SOCC抑制剂SKF-96365干预组:选择1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L多个浓度梯度;37℃培养箱内培养7d，然后于10倍光学显微镜下观察循环纤维细胞分化的情况，随机取5个视野拍照，并进行细胞计数。

3统计学处理本实验中所有数据均在Excel中完成分析，数值计量资料均以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间差异比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1循环纤维细胞的鉴定将分离所得PBMCs用无血清培养基培养7d后，光镜下可见部分贴壁细胞分化为长梭形，形态上符合已分化的循环纤维细胞的特征(图1)，与文献报道一致［11］;免疫组织化学检测细胞分子标记的表达情况，冰丙酮固定细胞并破膜后，用TRITC连接的CD45抗体和FITC连接的ColI抗体对细胞进行染色，经生物素亲和素的信号放大作用，荧光显微镜下可同时观察到TRITC的红色荧光和FITC的绿色荧光，证实梭形细胞能够同时表达CD45和ColI分子。

2RT-PCR和real-timePCR检测循环纤维细胞中ORAI1-3和STIM1-2的mRNA表达RT-PCR结果显示各基因引物特异性良好，条带特异且PCR产物大小符合预期，同时也表明了这批引物能够用于real-timePCR检测，凝胶电泳检测结果见图3。进一步使用这些引物我们在6个志愿者的人体循环纤维细胞中对ORAI1、ORAI2、ORAI3、STIM1和STIM2进行了real-timePCR的检测。结果显示，ORAI1mRNA的表达量明显高于ORAI2和ORAI3;而STIM1mRNA的表达量也高于STIM2，表明ORAI1和STIM1是循环纤维细胞SOCC的主要构成和调节分子，见图4。

3SOCC抑制剂SKF-96365对循环纤维细胞分化的影响SKF-96365是SOCC的非特异性抑制剂，研究表明在SKF浓度为10μmol/L时，基本上对细胞无毒害作用［12］。如图5所示，无血清培养基培养的PBMCs在加入较低浓度(1μmol/L和3μmol/L)的SKF-96365时，循环纤维细胞的分化过程即受到明显的抑制，且具有很强的浓度依赖性，即浓度越高抑制越明显。当SKF-96365的浓度为10μmol/L时，能抑制大部分循环纤维细胞的分化。

三、讨论

气道重塑是慢性哮喘的重要特征，其病理改变包括气道上皮下纤维化及肌成纤维细胞聚积［13］。许多研究都表明循环纤维细胞是参与哮喘结构和功能损害的重要因素。最早在2003年Schmidt等［14］发现在哮喘患者的气道中含有循环纤维细胞(CD45+/CD34+和ColI为识别标记)，而且这些细胞随着患者接触过敏原增多而数量增多。一项独立研究发现严重难治性哮喘患者的支气管活检样本中支气管壁中循环纤维细胞数量较正常组明显升高，而外周血中的循环纤维细胞数量也明显升高［8］。最近一项临床研究也发现哮喘患者外周血中的循环纤维细胞数量与哮喘的严重程度呈正相关，可以作为临床严重哮喘的生物学标志［15］。SOCC是非兴奋性细胞胞外Ca2+内流的主要通道，参与了基因转录、细胞凋亡、肌肉收缩、炎症和应激等多种生理和病理生理过程。有研究表明ORAI1和STIM1两种蛋白是构成SOCE通道的重要组成部分。ORAI是近年来发现的一种位于细胞膜上的4次跨膜离子通道蛋白，哺乳动物ORAI家族中有3个成员:ORAI1、ORAI2和ORAI3，其中ORAI1是最重要的SOCE的效应蛋白。研究表明ORAI1可以和ORAI2、ORAI3复合体来介导SOCE［16］。STIM家族成员包括STIM1和STIM2。在哺乳动物研究中发现STIM1是SOCC的重要调节分子，而STIM2主要与维持钙库的稳定有关。STIM1是分子量为77kD的跨膜蛋白，主要位于ER膜上，它具有感受钙池充盈状态并将感受信号通过不同蛋白作用机制传递给ORAI及TRPC通道的双重功能，是共同介导SOCE的关键分子［17］。我们的mRNA表达研究表明，体外培养的循环纤维细胞均表达这些SOCC相关蛋白，其中以STIM1和ORAI1的表达最为丰富，提示STIM1和ORAI1是循环纤维细胞SOCC的主要构成分子和调节分子。

单核细胞是循环纤维细胞的前体，SOCC介导的钙离子内流参与单核细胞的激活、增殖、分化及细胞因子的分泌等多种生理过程［18］。我们的既往研究显示，在单核细胞分化而来的巨噬细胞和树突状细胞［12，19］，SOCC发挥了重要功能，对树突状细胞的成熟和抗原递呈等功能具有调节作用，并有可能参与哮喘气道炎症过程。循环纤维细胞同样由单核细胞分化而来，因此，理论上SOCC同样会发挥功能调控作用。我们的研究结果证实了SOCC调控循环纤维细胞的分化过程。成纤维细胞和肌成纤维细胞可由循环纤维细胞分化而来，其基因表达和炎症介质释放等多种细胞功能调控与非选择性的SOCC密切相关［20-21］。因此，循环纤维细胞的分化以及其进一步的分化为成纤维细胞和肌成纤维细胞的过程均受到SOCC的影响，提示SOCC可以作为一个节点分子，调节循环纤维细胞参与的病理生理过程，比如慢性哮喘的气道重塑过程。下一步我们将用体内实验进一步验证SOCC抑制后对循环纤维细胞在慢性哮喘气道重塑中的作用的影响。本实验结果显示循环纤维细胞表达SOCC相关基因，并且SOCC的活性影响循环纤维细胞的分化，表明SOCC是循环纤维细胞功能的重要调节机制。

作者：钟金男 兰兰 何光珍 黄革 杨炯 高亚东 单位：武汉大学中南医院呼吸内科