基因甲基化与喉鳞状细胞癌的关系范文

《医学研究生学报》2014年第六期

1资料与方法

1．1实验方法

1．1．1主要试剂及仪器蛋白酶K(北京艾比根生物技术有限公司);Tris．Base(上海拜沃生物科技有限公司);WizardDNAClean-UpSystem(Promega公司);Tap酶(Invitrogen，USA);甲基化转移酶(M．SssI)(NEB公司，美国);引物、三氯甲烷、饱和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸钠、无水乙醇(大连宝生生物公司)。恒温水浴箱(SHELLAB公司，美国);高速离心机(Eppendorf公司);GeneAmp9700型PCR扩增仪(ABI公司，美国);凝胶自动成像仪(TOCAN320型);电泳仪(伯乐公司，美国)。

1．1．2DNA提取采用标准蛋白酶K消化法进行DNA提取，在提取之前，组织标本经HE染色证实肿瘤细胞的存在，并选择恶性肿瘤细胞≥75%的区域的组织提取DNA。

1．1．3亚硫酸氢钠修饰参照《分子克隆实验指南》进行操作［6］:先将约2μgDNA在1．5mLEP管中，用双蒸水稀释至50μL，加5．5μL新鲜配制的3molNaOH后42℃水浴30min，然后加30μL10mmol/L对苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520μL3．6mol亚硫酸氢钠(配制:1．88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3mol/LNaOH滴定溶液至PH5．0，最终体积为5mL)。EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液，加200μL石蜡油，50℃避光水浴16h。

1．1．4修饰后的DNA纯化回收预热树脂10min(37℃)，将移液器枪头伸入石蜡油层下吸取混合液600μL至一洁净2mLEP管中;然后使用PromegawizardCleanupDNA纯化回收系统，对修饰后的DNA进行纯化回收。

1．1．5甲基化特异性PCR反应PCR反应体系:去离子水11．65μL;10×buffer2μL;dNTP1．6μL;上、下游引物各1μL;DNA模板3μL;Tap酶0．15μL;加去离子水至20μL。循环参数:94℃预变性5min后35个循环:94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸30s，最后1个循环延伸5min。将产物琼脂糖凝胶(2．5g/L)电泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶处理正常人外周血细胞、去离子水分别作为甲基化阳性对照、甲基化阴性对照及空白对照。每批标本同时扩增甲基化和非甲基化阳性对照。甲基化上游引物:5''''-GTTAGTTTTTTTTTTTATTT-TAGTGGTTCGA-3''''，下游引物:5''''-TCCAAAACCTC-CCGAAAACGAAAACG-3'''';非甲基化上游引物:5''''-GGT-TAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3''''，下游引物:5''''-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3''''。

1．2统计学分析所有数据均采用SPSS20．0软件进行处理，RECK基因启动子区甲基化状况与临床病理参数的关系采用χ2检验，必要时采用Fisher确切概率法。对完成至少5年随访的患者行生存分析。生存曲线采用Kaplan-Meier法估计，并采用Log-rank检验分析不同组别的差异。危险因素与患者总体生存率的关系采用多因素COX比例风险模型分析，以P≤0．05为有统计学意义。

2结果

2．1临床及病理学特征70例患者中，共有37例(52．86%)发生RECK基因甲基化，经χ2检验，RECK基因甲基化在不同年龄、性别，吸烟、饮酒、淋巴结转移与否，TNM分期间差异无统计学意义(P＞0．05);肿瘤组织中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率远远高于分化程度较低的患者。15名正常人喉黏膜组织均未发现甲基化。见表1。

2．2喉鳞状细胞癌及正常组织的甲基化情况37例(52．86%)原发喉鳞状细胞癌标本发生甲基化，见图1。29对喉鳞状细胞癌-癌旁组织匹配的标本中，喉鳞状细胞癌组织发生RECK基因甲基化16例(55．12%)，癌旁组织发生RECK基因甲基化8例(27．59%)，经配对四格表资料的精确概率检验，2组的甲基化率比较差异有统计学意义(P=0．029)。见表2。

2．3RECK基因启动子区甲基化与患者的生存预后的关系本组70例患者中，64例完成了5年随访，中位无瘤生存期为41个月，中位总体生存期为52个月。本研究只针对完成5年随访的64例患者分析RECK基因启动子区甲基化与生存预后的关系。经Log-rank分析，RECK基因甲基化可明显缩短患者的无瘤生存期和总体生存期(P=0．017，P=0．024)，见图2。此外，有淋巴结转移、Ⅲ-Ⅳ级临床分期、肿瘤组织中等及高分化与患者较差的预后有关，有淋巴结转移、Ⅲ-Ⅳ级临床分期可明显缩短患者的无瘤生存期和总体生存期。肿瘤组织中等及高分化可缩短患者的无瘤生存期。见表3。行多因素COX回归(ENTER)分析，无瘤生存期及总体生存期的COX回归方程拟合效果均较好(χ2=12．374，P＜0．001;χ2=24．123，P=0．001)，结果显示:RECK基因甲基化是患者无瘤生存期的独立危险因素;总体生存期的独立危险因素为:有无淋巴结转移、临床分期、RECK基因甲基化，提示:RECK基因甲基化与喉鳞状细胞癌患者的生存期具有重要的关系。见表3、表4。

3讨论

RECK基因启动子区的甲基化与许多恶性肿瘤的转移和浸润有关。本研究结果显示:RECK基因甲基化不仅在喉鳞状细胞癌组织中发生，而且在喉鳞状细胞癌旁正常组织中也会发生，并且在15名健康者正常组织中均未见RECK基因甲基化，说明抑癌基因甲基化可作为恶性肿瘤早期发生的生物学标志。本研究实验结果还发现29对喉鳞状细胞癌组织-癌旁组织匹配的标本中，有3例仅在癌旁组织中发生了甲基化，而相对应的喉鳞状细胞癌组织中未发现RECK甲基化，提示病理学正常的组织发生RECK基因甲基化可能预示着恶性肿瘤附近的组织具有一个范围较大的潜在的甲基化区域，在肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤中也发现了类似的规律，因此，抑癌基因启动子区甲基化可看做是恶性肿瘤的一类癌前病变［7］。RECK基因一种新型抑癌基因，定位于9P13-9P12，通过抑制基质金属蛋白酶(matrixmetallopepti-dase，MMP)而实现抑制肿瘤细胞再生、浸润和转移的作用［8－9］。有实验结果表明:在恶性肿瘤组织中，MMP2、MMP9均呈高表达，特别是MMP2的阳性表达与肿瘤分期、淋巴结状态等病理特征具有重要关系［10－11］。有研究提示，RECK基因高表达的肿瘤患者的生存预后明显优于RECK基因低表达者［12］。

这与本实验结果综合提示:喉鳞状细胞癌RECK基因由于甲基化而灭活，从而使患者的生存预后更差［11，13］。因此，去甲基化可应用于抗肿瘤的治疗过程中，可为改善包括喉鳞状细胞癌在内的恶性肿瘤患者的治疗带来新希望［15］。以往有研究表明:吸烟、饮酒是影响恶性肿瘤患者生存的危险因素，这一规律也得到了很多学者的认同［16］。但本研究发现吸烟、饮酒与患者的生存率关联不大，但这并不意味着吸烟、饮酒不是喉鳞状细胞癌患者生存率的影响因素。喉癌的早期症状为声音嘶哑、有异物感、痰多、咽部不适等，这些症状的存在，可能会使患者减少吸烟、饮酒，从而减弱了其与喉鳞状细胞癌的真实关联。因此，吸烟、饮酒仍然是影响喉鳞状细胞癌患者生存的潜在危险因素，并具有重要的公共卫生学意义。本研究重点分析了RECK基因启动子甲基化状况与预后的关系。结果表明:甲基化的RECK基因检测是预测患者较差预后的新途径，越来越多的研究结果支持这一观点［12－13］。RECK基因启动子区甲基化是人喉鳞状细胞癌的早期事件，在癌旁正常组织中也可发生，并且与患者较差的预后有重要关联。RECK基因启动子区甲基化可作为一个重要的早期发现并预测患者预后的早期生物标志物。

作者：崔静李辉田艳勋单位：邢台市人民医院耳鼻咽喉科