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普纳替尼对人血管内皮细胞的影响范文

时间:2022-06-29 03:18:24

普纳替尼对人血管内皮细胞的影响

《药物评价研究杂志》2015年第三期

1方法

1.1Ponatinib细胞毒活性测定采用CCK-8法[4]检测Ponatinib对正常HUVECs的细胞毒作用。用含10%FBS的DMEM高糖培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养HUVECs细胞,收集5~8代处于对数生长期的细胞消化、重悬、计数,以5×104/mL密度每孔100μL接种细胞至96孔板。待细胞贴壁后,去除培养液,对照孔加入不含药物的新鲜培养液100μL,给药组每孔加入不同浓度的含药培养液100μL,设3个复孔,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h,每孔加入CCK-8试剂10μL,于CO2培养箱中孵育1h后,用酶标仪于450nm波长下测定吸光度(A)值。使用GraphPadprism5.0软件拟合非线性曲线,并计算Ponatinib对HUVECs细胞的半数抑制浓度(IC50)。抑制率=(A阴性-A样品)/A阴性

1.2Ponatinib对细胞迁移能力影响采用体外划痕试验[5]观察Ponatinib对HUVECs细胞迁移能力的影响。将5×104/mL的HUVECs细胞接种至24孔板,每孔500μL,24h后,用灭菌的10μL枪头在单层细胞上呈“一”字划痕,吸掉培养液,用PBS清洗3遍,去除划掉的细胞,每孔加入药物浓度依次为0.01、0.05、0.10μmol/L的含药培养液500μL,每个浓度设置3个复孔,以不含药物的孔作为阴性对照,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养,直至阴性对照组划痕两侧的细胞布满划痕后拍照观察,并对各组迁移至划痕中央的细胞进行计数,计算迁移率。迁移率=药物组划痕区域细胞数/对照组划痕区域细胞数

1.3Ponatinib对细胞成管能力影响采用体外血管形成试验[6]考察Ponatinib对HUVECs细胞成管能力的影响。将100μL枪头、96孔板、Matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜预冷。于96孔板加入Matrigel基质胶50μL/孔,37℃、5%CO2培养箱中温孵0.5~1h。取融合80%~90%HUVECs细胞以3.0×104/孔的密度接种到96孔板,分别加入10μL的含药培养液使Ponatinib终浓度依次为0.01、0.05、0.10μmol/L,每组设3个复孔。温孵10h后于倒置显微镜低倍镜下观察拍照,记录各组细胞成管情况,根据管型情况进行评分:细胞形成闭合的多边形评4分,细胞排列呈多边形但未闭合评3分,细胞排列呈线性结构评2分,细胞未成管散在或聚集成簇评1分[7]。

1.4Ponatinib对细胞NO释放的影响将HUVECs细胞以1×106/孔的密度接种至6孔板,24h后,每孔加入浓度依次为0.01、0.05、0.10μmol/L的含药培养液2mL,每个浓度设置3个复孔,以不含药物的孔作为阴性对照,于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24~48h,取细胞上清液100μL,按照NO硝酸还原法试剂盒说明书的方法进行检测。

1.5统计学分析采用GraphPadprism5.0软件进行One-wayANOVA分析[8]。数据采用x±s表示。

2结果

2.1HUVECs细胞毒作用结果表明Ponatinib对HUVECs细胞株增殖显示出较强的抑制作用。随着药物浓度的升高,抑制率也升高,在0.1~10μmol/L呈现出典型的浓度相关性(图1)。使用GraphPadprism5.0软件计算得到Ponatinib对HUVECs细胞的IC50为(0.69±0.05)μmol/L。另外,0.01、0.05、0.10μmol/L浓度的Ponatinib对HUVECs细胞的抑制率小于10%,对细胞的增殖影响较小,可作为Ponatinib的非毒性剂量用于考察该药物对细胞迁移、成管及NO水平的影响。

2.2细胞迁移能力影响相同作用时间下,给药组的细胞向划痕中央迁移的数量明显少于对照组,说明经药物处理后的HUVECs细胞的划痕愈合能力与对照组相比较差,且随着Ponatinib浓度的增加,差异越显著(P<0.05)(图2和表1),即Ponatinib对血管内皮细胞迁移能力的影响呈剂量相关性,药物浓度为0.01μmol/L时已经达到半数抑制率。

2.3细胞成管能力的影响由HUVECs细胞成管图像可得,不同浓度Ponatinib作用下,HUVECs细胞在Matrigel基质胶上血管形成情况存在显著差异(图3)。成管评分结果显示,0.05、0.10μmol/L的Ponatinib组评分均显著低于对照组(P<0.05)(图4),说明非毒性剂量的Ponatinib能剂量相关地抑制HUVECs细胞的血管形成能力。

2.4细胞NO释放水平影响不同浓度Ponatinib处理HUVECs细胞24h和48h后,采用硝酸还原法间接检测细胞上清液的NO浓度,结果显示,相同作用时间下,给药组的细胞培养液中的NO浓度明显低于对照组(P<0.05)(表2),表明Ponatinib抑制HUVECs细胞NO的合成与释放,且作用时间越长,NO浓度降低越显著。

3讨论

Ponatinib为典型的靶向抗癌药物,为小分子多激酶抑制剂,主要作用于BCR-ABL、血管内皮生长因子受体(VEGFR)等多种激酶。FDA相关资料报道,Ponatinib诱发血栓及其他血管毒性与Ponatinib对VEGFR的抑制作用有关,并预测可能与索拉菲尼(Sorafenib)、帕唑替尼(Pazopanib)、舒尼替尼(Sunitinib)及贝伐单抗(Bevacizumab)等VEGF信号通路(VSP)抑制剂血管不良反应机制密切相关[9]。近年来,VSP抑制剂如索拉菲尼等引发的血管毒性不良反应频繁报道[10]。VSP抑制剂通过阻断VEGF-VEGFR相互作用,阻断其下游信号PI3K/AKT/eNOS等通路的传递,进而影响血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成等正常生理功能,导致血管内皮损伤[11];另外,当血管内皮细胞功能受损时,其凝血与抗凝血、纤溶与抗纤溶的平衡会失调[12]。而凝血系统激活、纤溶系统失活及血小板黏附聚集是血栓形成的重要环节。NO是由血管内皮细胞产生的一种气体信号分子,通过促进血管舒张、抑制血小板聚集和白细胞黏附调节血管的功能[13]。正常生理状态下,机体主要通过AKT/eNOS通路调节p-eNOS的表达,进而调控血管内皮细胞对NO的合成释放来实现对血管收缩和舒张功能的调节[14]。NO活性降低会诱发多种病理变化,包括改变内皮的抗凝功能,干扰内皮的生长和再生功能[15]。

本文以此为研究依据,从Ponatinib对正常血管内皮细胞的功能影响方面初步考察Ponatinib致血栓的相关机制。研究发现,Ponatinib对HUVECs细胞的IC50为(0.69±0.05)μmol/L,而45mg单次口服剂量的Ponatinib在恶性血液病患者体内的血药浓度峰值(Cmax)为(0.161±0.098)μmol/L[16],即Cmax范围为0.063~0.25μmol/L,结合细胞毒性实验数据分析,在此浓度范围内的Ponatinib对人血管内皮细胞有不同程度的毒性作用;另外,本研究还发现低于人体内Cmax的Ponatinib(0.01~0.1μmol/L)能够显著抑制HUVECs细胞的迁移、血管形成及NO的释放(P<0.05)。提示Ponatinib可能通过抑制内皮细胞增殖、迁移、血管形成,影响NO合成导致内皮细胞功能障碍,从而改变血管内皮的抗凝、生长及再生功能,最终诱发动静脉血管狭窄、血栓等病理变化。对PI3K/AKT/eNOS等信号通路相关机制有待进一步研究。目前,Ponatinib在临床治疗中具有不可替代性,因心血管毒性影响其使用,期待该药全面评估安全性并通过改造恢复其临床广泛应用。

作者:张亚楠 孙继红 黄新益 项仪宾 余伯阳 单位:中国药科大学 南京圣和药业股份有限公司

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