基因芯片对鸡法氏囊差异的表达范文

《畜牧兽医学报》2014年第八期

1荧光定量PCR

为验证芯片的结果，本研究选择了6个差异表达基因，根据GenBank中的基因序列，通过网络在线软件Primer－BLAST（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／tools／primer－blast）设计了几对特异性引物（引物序列见表1），进行荧光定量PCR，通过2－△△CT进行计算。引物由上海Invitrogen公司合成。RNA样本中基因组DNA的去除和cDNA合成按照试剂盒（TaKaRa，China）说明书进行操作。荧光定量PCR按照试剂盒（TaKaRa，China）说明书在7500型荧光定量PCR仪（ABI，Singapore）上进行。以3－磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase，GAPDH）基因作为内参基因进行数据的标准化处理。反应体系（20μL）：SYBRGreenⅡ（2×）10μL，上下游引物各2μL，ROXⅡ（50×）0．4μL，超纯水4．5μL，模板（cD－NA）1．1μL。反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。通过Spearman检验对基因芯片和RealtimePCR2种方法的结果进行相关性分析。

2结果

2．1法氏囊组织RNA提取质量鸡胚或鸡法氏囊组织样本（n＝3）的总RNA经试剂盒提取后，经检测，所有的总RNA质量均较好（RIN≥7．0，且28S／18S≥0．7，为合格［16］），纯度较高。

2．2不同时间点法氏囊组织中基因的检出率及检测的变异系数在鸡胚18日龄时，基因的检出率比较高，而10和30日龄时稍低；变异系数（CV）虽然随着日龄增加，其数值在增加，但其均值均低于10％（表2）。

2．3不同时间点法氏囊组织差异表达基因数差异倍数在2倍及以上且P＜0．05的基因为差异表达基因。比较不同日龄之间鸡法氏囊差异表达的基因数目结果见表3。从表3中可以看出，随着日龄的增加，或者说随着鸡法氏囊发育的完善，差异表达基因数目逐渐减少，如30日龄雏鸡与18胚龄鸡胚之间比较，有5043个差异基因，10日龄雏鸡与18胚龄鸡胚之间比较，有2368个差异基因，而30与10日龄雏鸡之间比较，有1874个差异基因。其中，在日龄差距比较大时（30日龄雏鸡与18胚鸡胚之间），下调基因数目比较多，约3120个，而日龄差距较小时，下调基因数目基本没有变化，约在1330个左右；而上调基因数目有一些减少，从1923个（30日龄雏鸡～18胚龄鸡胚）降低到1035个（10日龄雏鸡～18胚龄鸡胚），再降到544个（30～10日龄雏鸡）。

2．4差异表达基因GO功能分类分析对差异表达基因进行GO（GOontology）功能分类，如图1所示。在分子功能方面，有9．97％（236／2368）～10．07％（508／5043）的差异基因参与结合功能，有3．73％（188／5043）～4．6％（109／2368）的差异基因参与催化功能，而仅在30日龄雏鸡与18胚龄鸡胚比较时有0．02％（1／5043）～1．84％（93／5043）的差异基因参与了抗氧化活性、转录调节、酶调节、分子转导等的功能。在细胞组成方面，有7．59％（383／5043）～8．75％（164／1874）的差异基因参与细胞组成，3．51％（177／5043）～4．11％（77／1874）的差异基因参与细胞器组成，1．81％（34／1874）～2．54％（60／2368）的差异基因参与胞外区组成，而仅在30日龄雏鸡与18胚龄鸡胚比较时约有0．2％（10／5043）的差异基因参与了突触的功能。在生物学加工方面，有5．02％（941874）～5．83％（138／2368）的差异基因参与代谢过程，8．22％（154／1874）～8．36％（198／2368）的差异基因参与细胞加工，2．08％（39／1874）～3．03％（153／5043）的差异基因参与发育加工过程，4．27％（80／1874）～5．14％（259／5043）的差异基因参与生物学调节过程，0．48％（9／1974）～0．67％（34／5043）的差异基因参与免疫系统加工过程，而仅在10日龄雏鸡与18胚龄鸡胚比较时约有0．38％的差异基因参与多个生物过程，而仅在30日龄与18胚龄比较时有0．02％（1／5043）～0．1％（5／5043）的差异基因参与了细胞杀伤、色素沉积等功能。

2．5差异表达基因的信号通路分析对差异表达基因通过KEGG数据库进行信号通路分析，富集检测的P＜0．05的信号通路总共有36条（表4）。其中10日龄雏鸡与18胚龄鸡胚之间的差异基因涉及到21条信号通路，独有的信号通路有9条；30与10日龄雏鸡之间的差异基因涉及到12条信号通路，独有的信号通路有4条；30日龄雏鸡与18胚龄鸡胚之间的差异基因涉及到23条信号通路，独有的信号通路有8条；差异基因涉及到共同的信号通路有5条。

2．6差异基因的荧光定量PCR验证为验证基因芯片所筛选的差异表达基因，随机选取了6个基因（30日龄雏鸡～18胚龄鸡胚），以GAPDH为参照基因，用荧光定量PCR的方法进行了验证。2种检测方法的结果通过Spearman检验进行相关分析，结果Spearman相关系数r＝0．9429，P＝0．0167，说明基因芯片中差异表达基因的表达变化情况与荧光定量PCR验证的结果是一致的（表5）。

3讨论

法氏囊在胚胎时期就开始发育，在雏鸡出壳后发育迅速，免疫性能逐步完善。在这个过程中，基因组的序列并没有发生变化，但其表达呈有序的时空变化，这种变化在转录组水平上得到体现。转录组的有序变化调控着机体的生命活动。因此，对转录组进行研究，有望为组织的发育与功能研究进行理论和方法学的探索。本研究通过基因表达谱芯片技术探讨了鸡法氏囊发育过程中转录组的变化，得到了法氏囊发育相关的大量的基础信息，为深入研究法氏囊发育的分子机制提供了依据。白细胞介素（interleukin，IL）调节免疫细胞的活化、分化和增殖，与其受体结合后调节免疫反应。在本研究中，IL1B、IL6、IL7、IL8、IL15和IL17D等被鉴定为差异表达基因。IL6是一种具有抗炎作用的细胞因子，IL7有利于B细胞的增殖［18］。IL8是一种趋化因子，可以趋化中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，进而引发炎症反应和过敏反应。在本研究中，IL6、IL7和IL8呈下调表达。这表明，随着法氏囊发育成熟，IL6的抗炎作用、IL8引发炎症的能力和IL7调节B细胞增殖的作用逐渐下降。IL1B可以促进T和B细胞的生长与分化，本研究中IL1B早期呈上调表达，表明IL1B是在法氏囊发育早期促进淋巴细胞的发育。信号通路通过受体结合将细胞外信号传递到细胞内引发一系列的生理或病理反应。在本研究中，TLR信号通路和NLR信号通路被富集为显著的信号通路。差异表达基因如CCL5（chemokine（C－Cmotif）ligand5）、CD80、IL1B、MAP2K4（mitogen－activatedproteinkinasekinase4）、MAPK11（mito－gen－activatedproteinkinase11）和SPP1（secretedphosphoprotein1）等可能通过Toll样受体信号通路参与了法氏囊的发育，差异表达基因如CCL5、IL1B、IL6、MAPK11、PSTPIP1（proline－serine－threoninephosphataseinteractingprotein1）和TRAF6（TNFreceptor－associatedfactor6）等涉及到了核苷酸寡聚化域样受体信号通路。而NLR和TLR是机体重要的病原识别的信号通路，引起抗微生物感染的天然免疫应答。在本研究中，法氏囊发育早期，有差异基因涉及到这2个信号通路，而到法氏囊发育后期，没有差异基因涉及到这2个信号通路。鸡在免疫系统尚未发育完善时受到病原感染后，宿主的先天免疫功能来不及发挥作用，进而发展为疾病。共黏连信号通路（focaladhesionsignalingpathway）在维持正常细胞结构中具有重要功能。在本研究中，一些编码胶原成分的差异表达基因如Col1A2（collagen，typeI，alpha2）、Col3A1、Col4A1、Col4A2、Col5A1、Col5A2、Col6A1、和Col6A3等涉及到共黏连信号通路。胶原是细胞外基质的主要结构成分。4型胶原（由Col4A1和Col4A2组成）是基底膜（包括血管壁）的重要成分，Col4A1在胚胎发育过程中基底膜形成时为其他整合成分提供支架［24］。Col5A1是许多结缔组织中Ⅰ型富含胶原纤维的成分，可以调节由Ⅰ和Ⅴ型胶原组成的其他类型纤维的直径。Col6A1是微型纤维的结构成分，参与了细胞迁移、分化和胚胎发育［26］。其它一些参与共黏连信号通路的差异表达基因在法氏囊发育方面可能也发挥了一些作用，如ITGA9（integrin，alpha9）对淋巴管瓣形成是必须的，ITGB5（integrin，beta5）参与了细胞黏附和整合信号的传导，LAMA1（laminin，alpha1）是层黏连蛋白111的主要成分，而层黏连蛋白111在基底膜形成中有重要作用［29］。鸡法氏囊的发育是一个复杂的过程，很多的基因和蛋白参与了这个过程。本研究初步探讨了法氏囊发育过程中基因表达的变化，为研究相关基因在法氏囊发育过程中所起的作用提供了理论依据，相关差异基因的蛋白质水平变化还有待进一步深入研究。

作者：杭柏林 桑建君钱琨叶建强邵红霞金文杰梅梅缪佶秦爱建单位：扬州大学兽医学院河南科技学院动物科学学院