猪肺炎支原体对上皮细胞损伤的影响范文

《畜牧兽医学报》2014年第八期

1方法

1．1Mhp菌液培养Mhp168株和Mhp168L株接种于KM2培养基中。以1∶10复壮，待菌液培养至对数生长期时备用。

1．2SJPL细胞培养SJPL细胞培养于含10％小牛血清、100U•mL－1青霉素和100U•mL－1链霉的DMEM培养液，待细胞生长达90％时，胰蛋白酶消化，稀释至1．5×105•mL－1，以100μL•孔－1接种于96孔培养板，在37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。

1．3Mhp感染细胞取新鲜培养的处于对数生长期的Mhp168和Mhp168L菌液以12000r•min－1，离心20min，菌体沉淀用PBS洗涤1次，用DMEM培养基（无血清）重悬。96孔板中的SJ－PL细胞弃去上清，然后用PBS洗涤3次。DMEM（无血清）培养基重悬的Mhp接种于铺有细胞的孔中，对照组接种等体积的DMEM（无血清）培养基，37℃、5％CO2的培养箱中培养。

1．4感染时间、剂量的筛选在感染12、24、36、48h时取细胞上清，用NO试剂盒测定NO浓度；取细胞用MTT法测定细胞活力，找出差异显著的感染时间点；用感染剂量为1×106、3×106、5×106和7×106CCU的Mhp感染细胞，利用上一步确定的感染时间，检测细胞活力及NO。

1．5H2O2检测取感染好的细胞，先将细胞收集到离心管中，弃上清，加入过氧化氢检测裂解液，充分匀浆以裂解细胞，4℃，12000r•min－1，5min，取上清，按照H2O2试剂盒测定方法检测。

1．6免疫荧光法检测PBS洗涤未黏附的Mhp3～5次，每次5min；无水乙醇4℃固定30min。PBS洗涤5次，1％BSA37℃封闭30min，PBS洗涤3～5次，与MhpP46单抗（1∶1000稀释）37℃孵育1．5h，PBS洗涤3～5次，与FITC－羊抗小鼠IgG（1∶200稀释）37℃孵育1h，PBS洗涤3～5次，荧光显微镜观察，拍照。

1．7DAPI染色免疫荧光拍照后，将96孔板用PBS洗涤5次，每次5min，加入DAPI染色5min，PBS洗涤3次，每次5min，荧光显微镜观察，拍照。

1．8统计分析测定结果使用SPSS15．0软件进行One－wayANOVA分析。

2结果

2．1感染时间和感染剂量的筛选

2．1．1不同感染时间后细胞上清NO浓度和细胞活力从图1可以看出，在36h时，Mhp168和Mhp168L感染细胞后，细胞活力相同，但Mhp168引起的NO浓度显著（P＜0．05）高于Mhp168L。

2．1．2不同感染剂量36h后细胞上清NO浓度从图2可以看出，不同感染体积，细胞活力无差异，但在感染量为5×106CCU时，其NO浓度显著性高于其它感染体积（P＜0．01），并且Mhp168显著性高于Mhp168L（P＜0．05）。

2．25×106CCUMhp感染细胞36h后测定的H2O2浓度结果显示，在感染36h后，Mhp168和Mhp168L感染SJPL细胞产生的H2O2浓度极显著（P＜0．01）高于对照，而Mhp168感染细胞产生的H2O2也显著（P＜0．05）高于Mhp168L。

2．3Mhp5×106CCU感染细胞36h后IFA检测Mhp168和Mhp168L对SJPL细胞影响的间接免疫荧光结果见图4，与对照相比，Mhp168L在SJ－PL上的黏附量高于Mhp168。

2．4Mhp5×106CCU感染细胞36h后DAPI染色对感染细胞进行DAPI染色如图5。与对照相比，Mhp168感染后，细胞受到损伤，细胞膜破损，染色质向外周聚集，呈絮状，细胞体积明显肿胀变大，而Mhp168L感染的细胞，细胞体积也增大，Mhp168L对细胞损伤较轻，其细胞周边也有较少的染色质聚集。

3讨论

Mhp168株是野毒分离株，具有一定的感染性，为江苏省农业科学院兽医研究所早期分离鉴定。168株经多年的连续传代培育为适应无细胞培养基（KM2）的人工致弱毒株，即168L株，已用该菌株研发成功具有良好的安全性和免疫保护效力的弱毒活疫苗，可有效预防猪气喘病的发生。猪肺炎支原体致病株168株和弱毒株168L株是来源于同一母本株的不同毒力株，全基因组分析显示基因组差异较小，选这两株同一来源不同毒力的Mhp感染细胞，并对其进行氧化损伤分析，可为该病的致病机制研究提供非常良好的理论基础。这在国内外属于首次报道。猪肺炎支原体可以黏附于猪呼吸道上皮细胞、猪肺泡上皮、猪肾细胞PK15、微型猪肺纤维原细胞WWPL和人肺纤维原细胞MRC－5。车巧林等用猪肺炎支原体XLW－1黏附猪肾细胞PK－15从而建立猪肺炎支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测的方法，张旭等也利用间接免疫荧光法检测了不同毒力支原体分别对猪肾细胞PK－15的黏附情况。众多的文献研究猪肺炎支原体感染猪气管上皮细胞，而利用Mhp强弱毒株体外感染靶细胞后的氧化损伤差异分析却未见报道。

作者希望对强弱毒株感染细胞的氧化损伤差异进行分析，从Mhp感染细胞后的反应中获得宿主的差异表达方面，通过分子病理学，分子免疫学，转录组学、蛋白组学、代谢组学等多方面来共同进行研究，只有这样才能更加全面准确地解释和揭示猪肺炎支原体的致病机制，才能对猪支原体肺炎的防治和诊断起到积极的作用。

作者：李彦伟刘茂军刘蓓蓓武昱孜倪博白方方纪燕张映 邵国青单位：江苏省农业科学院兽医研究所／农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心山西农业大学南京农业大学动物医学院