SLE患者外周血浆细胞变化研究范文

摘要：本文通过研究新疆维吾尔族SLE患者外周血pDC的变化，探讨其在维吾尔族SLE发病中的作用。采用流式细胞术检测外周血pDC水平，ELISA检测血清IFN－α、IL－23浓度。研究发现SLE患者外周血pDC水平显著低于正常对照组，其中SLE活动组水平明显低于缓解组，其pDC水平与SLE活动性指数（SLEdiseaseactivityindex，SLEDAI）评分呈负相关；SLE患者血清IFN－α、IL－23水平明显升高，且两者浓度与pDC水平呈正相关。上述结果提示，维吾尔族SLE患者外周血pDC水平显著降低，并且与病情活动度相关，其相应细胞因子表达异常，引发机体的免疫异常，从而导致疾病的发生发展。

关键词：系统性红斑狼疮；浆细胞样树突状细胞；干扰素α；白介素23

SLE是以免疫性炎症为主的弥漫性结缔组织病，目前认为主要由免疫系统紊乱、多种自身抗体产生及细胞因子活性异常引起［1－2］，并导致全身多系统、脏器受损。SLE在女性中多见，尤其是20～40岁的育龄女性。研究发现SLE患者体内的体液免疫反应和细胞免疫反应均与DC功能异常密切相关，普遍认为自身抗原、DC和免疫应答是SLE发生和发展的3个关键环节［3］。DC是来源于骨髓单个核细胞的一组异质性细胞，数量稀少却广泛存在于人体组织中，作为APC，它在维持胸腺和外周免疫耐受中发挥重要作用。结构性去除DC可打破CD4＋T细胞的自我耐受状态，引起自身免疫病。根据不同的来源、受体和功能DC可分为髓样树突状细胞（myeloidden－driticcell，mDC）和浆细胞样树突状细胞（plasma－cytoiddendriticcell，pDC）［4］。pDC在不同分化阶段和不同刺激诱导下可表现出不同的免疫调节功能，其功能异常可引起自身免疫性疾病［5－8］。研究显示，pDC过度活化及产生的IFN－α、IL－23在SLE的发病过程中具有重要作用［3］。SLE临床表现多样，部分患者早期疾病表现不典型，极易误诊。近年世界医疗组织研究发现SLE的发病率与种族有很大关系，而种族是在体质形态上具有某些共同遗传特征的人群。因此，本课题组通过检测新疆维吾尔族SLE患者外周血pDC表达水平的变化，并研究其与IFN－α、IL－23表达水平的相关性，来探讨pDC在维吾尔族SLE患者发病中的作用。

1资料与方法

1．1临床资料

收集2014年1月至2016年1月新疆医科大学第二附属医院风湿免疫科60例维吾尔族SLE患者，诊断符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类标准，参照SLE活动性指数（SLEdiseaseactivityindex，SLEDAI）评分作为病情活动判断标准，SLEDAI评分大于8分，病情处于活动期，其中30例为病情活动组，30例为病情缓解组；30例新疆医科大学第二附属医院体检中心的维吾尔族健康人作为正常对照，均无风湿病史和风湿病家族史。各组间年龄、性别差异均无统计学意义（见表1）。所有患者知情同意并且实验经医院伦理委员会批准。

1．2方法

1．2．1标本采集采集受试对象空腹静脉血5mL，EDTA抗凝，分离血清，转移至Eppendorf管中，－80℃冰箱保存备用。采用标准Ficoll密度梯度离心法分离得PBMC。1．2．2主要试剂和仪器FITC标记的抗Lin1抗体、APC标记的抗CD123、抗HLA－DR抗体（美国BD公司）；IFN－α、IL－23ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；Statfax4200美国酶标仪（AWARENESS公司）1．2．3流式细胞术检测将PBMC悬液分装至5个流式管，调整体积为100μL，每管均加入FITC标记的抗CD11C抗体、APC标记的抗CD123、抗HLA－DR抗体，室温避光孵育30min。1000r／min离心5min，PBS洗涤2遍，离心，弃上清，加2％多聚甲醛固定。流式细胞仪检测中CD123＋DC即pDC，运用CellQuest软件分析pDC细胞数量（见图1）。图1流式细胞仪数据分析1．2．4细胞因子IFN－α、IL－23水平检测操作均按试剂盒说明书进行，取血清和不同稀释倍数的标准品100μL加入ELISA试剂盒96孔板中；加入人生物素标记抗体（Biotin）100μL；室温18～25℃孵育2h，洗涤，甩干；加辣根过氧化物酶亲和素，室温18～25℃孵育1h，洗涤，加入TMB显色，室温避光孵育10～15min；加终止液；读取酶标仪测得D（450nm）值，根据标准曲线计算IFN－α、IL－23浓度。1．3统计学处理采用SPSS11．5软件进行数据统计分析。定量资料用x±s表示。按照分组进行方差齐性分析，若齐性行独立样本t检验，不齐行Mann－Whitney秩和检验，分析相关性时，采用双变量相关分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2实验结果

2．1SLE患者外周血pDC水平

SLE患者外周血pDC水平（0．067±0．035）显著低于正常对照组（0．152±0．061），差异有统计学意义（P＜0．05），其中活动组pDC水平（0．048±0．021）％明显低于缓解组（0．074±0．031）％，差异有统计学意义（P＜0．05），见表2，图2。

2．2活动组SLE患者SLEDAI评分与外周血pDC水平的相关性

活动组SLE患者SLEDAI评分与外周血pDC水平呈负相关（r＝－0．243），差异有统计学意义（P＜0．05），见表3。

2．3SLE患者血清IFN－α表达水平及其与pDC水平的相关性

SLE患者血清IFN－α水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05），且pDC水平与IFN－α水平呈正相关（r＝0．373，P＜0．05），见表2、3。

2．4SLE患者血清IL－23表达水平及其与pDC水平的相关性

SLE患者血清IL－23水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05），且pDC水平与IL－23水平呈正相关（r＝0．298，P＜0．05），见表2、3。

3讨论

SLE被认为是自身免疫性疾病的原型，目前其病因及发病机制尚不明确。易感个体在遗传、感染、紫外线等多种因素的综合作用下，T、B淋巴细胞异常活化，自身抗原免疫耐受缺失，最终导致SLE的发病［7］。国外研究显示由于SLE在不同人种和族裔的患病率、发病机制及病情演变过程等不尽相同，因此不同人种和族裔的SLE患者对于药物治疗的反应不同，亦可导致预后存在显著差异。DC是目前已知的功能最强的唯一能激活初始T淋巴细胞的APC，它可以摄取、加工处理抗原，并将抗原信息提呈给T细胞，诱导T细胞免疫反应和维持免疫耐受。它联系着固有免疫和适应性免疫，在机体的免疫应答中发挥重要作用。Ber－nasconi等［8］研究发现自身反应性T、B细胞引起的SLE可能是DC自身稳定性改变的结果，DC异常的激活参与了SLE的发病。pDC是目前被研究最多的DC亚群，有研究报道SLE患者外周血pDC减少，炎症组织和靶器官出现高水平pDC［9］。本研究通过检测新疆维吾尔族SLE患者外周血pDC水平，发现其计数显著低于健康对照组，其中活动组低于稳定组，表明pDC参与了SLE的发病，与国内外研究报道一致。目前认为SLE患者外周血中pDC水平下降不是细胞数量的下降，而是SLE患者体内pDC的分布与正常对照组不同［10］，也有研究认为与pDC过度凋亡以及自身发育异常有关［11－13］。课题组通过进一步分析发现，活动组pDC计数明显减少，并且与SLEDAI评分呈负相关，提示pDC水平与疾病活动有关。国内有文献报道，汉族SLE患者外周血pDC水平与SLEDAI评分无相关性［14］，是否与研究对象的种 族差异有关尚需进一步研究论证。pDC表现为浆细胞形态，含有丰富的内质网，表达CD4和高水平的IL－3aR，但是缺乏髓样抗原包括CD11c和大多数髓系标记。病毒感染时，pDC分泌大量IFN－α。在病毒／TLR刺激下，pDC通过IFN－α依赖性而非IL－12依赖性通路诱导初始T细胞向Th1分化［15－16］。在SLE患者体内IFN－α通路处于活化状态，敲除狼疮鼠IFN－α受体基因可使动物免于发病，由此IFN－α是SLE患者发病中重要的细胞因子之一［17－19］。在SLE患者体内存在大量免疫复合物，可激活pDC内的TLR9，引起一系列信号级联反应导致IFN－α大量合成［20－22］。IFN－α能够促进自身反应性T、B细胞增殖分化，从而引起自身免疫反应的异常，促进SLE的发病。在研究中发现，维吾尔族SLE患者IFN－α浓度也显著高于正常对照组，并且与pDC水平呈正相关，这与国内的汉族人群研究结论一致［14］，说明pDC通过分泌大量IFN－α参与了疾病的发生发展。成熟的DC分泌IL－23，同时细菌产物能够诱导DC持续表达IL－23。IL－23是Th17分化发育过程中起重要作用的细胞因子，主要作用于CD4＋T细胞，诱导其分化为Th17，后者通过分泌炎性细胞因子IL－17参与自身免疫性疾病的发病［23］。大量研究表明，IL－23在自身免疫性疾病如SLE、RA、干燥综合征及系统性硬化病等患者的血浆及组织中表达均升高。Puwipirom等［24］研究发现IL－23／IL－17轴参与到SLE动物模型和SLE患者的发病中。同样研究者发现维吾尔族SLE患者血清IL－23浓度也明显高于正常对照组，且与pDC水平呈正相关。以上研究结果与国内汉族SLE患者pDC及其IFN－α分泌的研究结论基本一致，说明pDC的异常是SLE患者共同的发病机制之一。SLE患者体内pDC被激活后分泌大量IFN和IL－23，并释放至外周血中，而在正常对照组中pDC不能被激活释放炎性因子，因此SLE患者组IFN－α和IL－23水平较正常对照组是升高的。同时发现SLE患者外周血pDC的数量与IFN－α和IL－23水平具有相关性，推测pDC可通过分泌大量IFN－α和IL－23引发机体的免疫异常，最终导致SLE发病。目前国外有研究报道［25］，在狼疮鼠模型中发现清除pDC后可降低体内IFN水平，同时能够减轻疾病症状，并且在人体前期和Ⅰ期临床试验中是安全有效的，表明pDC在SLE的发病中具有不可或缺的作用。pDC具有一般APC的共性，在免疫应答过程中发挥着重要作用，同时也表现出一些特有的生物学特性。在本次研究中发现，维吾尔族SLE患者外周血pDC水平显著降低，并且与病情活动度具有相关性，说明pDC计数可作为疾病临床监测的参考指标。并且维吾尔族SLE患者血清IFN－α、IL－23水平与pDC之间存在明显的相关性，推测pDC可能通过释放大量炎性细胞因子导致自身免疫过程的恶性循环。因此，pDC作为至关重要的免疫调控者，在维吾尔族SLE的发生、发展过程中具有不可或缺的作用，本结果有助于研究者深化对疾病发生机制的认识，从而为疾病的防治提供新的思路。

参考文献

［1］张琳，张伟．系统性红斑狼疮相关的生物标志物［J］．中国免疫学杂志，2007，23（9）：860－863． 

［6］张永亮，曹雪涛．浆细胞样树突状细胞免疫调节功能研究进展［J］．现代免疫学，2005，25（2）：167－170．

［14］周晶晶，汪国生，李向培，等．系统性红斑狼疮患者外周血浆细胞样树突状细胞的变化及意义［J］．中华微生物学和免疫学杂志，2013，33（5）：334－338．

作者：张继云 哈利 杨今言 赵旌 李文艳 单位：新疆医科大学第二附属医院