乳腺癌相关基因临床应用价值的探讨范文

摘要：目的探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）法检测外周血mRNA中B细胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）5种乳腺癌相关基因在乳腺癌诊断中的应用。方法FQ－PCR法测定50例健康女性体检者（健康对照组）、92例良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病组）和196例乳腺癌患者（乳腺癌组）外周血mRNA中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA的表达量。结果CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2和hMAMmRNA表达水平在乳腺癌组显著高于健康对照组和良性乳腺疾病组，差异有统计学意义（P＜0．05），其在健康对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义（P＞0．05）；5种基因mRNA在健康对照组和良性乳腺疾病组及乳腺癌组的Ⅰ期的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0．05），而乳腺癌组的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期则显著高于健康对照组、良性乳腺疾病组和乳腺癌组的Ⅰ期组的阳性表达率，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论采用FQ－PCR技术检测乳腺癌mRNA时，应考虑到质量控制、mRNA水平和异质性、肿瘤不同阶段等各个方面的因素，才能有效正确地将乳腺癌相关基因用于乳腺癌的诊断、治疗和预后。

关键词：荧光定量聚合酶链反应；BCL－2；CCND1；MUC1；HER－2；hMAM；乳腺癌

乳腺癌在女性恶性肿瘤发病率中排名第一，越来越多的乳腺癌相关基因成为研究热点，人们期望通过对相关基因的检测，及时准确地为乳腺癌诊断、治疗和预后提供可靠的实验室依据。荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）法检测乳腺癌外周血mRNA是近年来报道较多的研究方法，但是，纵观国内外FQ－PCR对乳腺癌外周血mRNA的报道，其阳性率差别较大［1－2］，因此，本文采用FQ－PCR法检测了目前研究得较多的，也是乳腺癌密切相关较为重要的5种基因———B细胞淋巴瘤／白血病－2基因（BCL－2）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、黏蛋白1（MUC1）、原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER－2）和人乳腺珠蛋白（hMAM）［3－6］在健康体检者、良性乳腺疾病患者和乳腺癌患者的外周血mRNA表达，目的在于探讨FQ－PCR检测乳腺癌相关基因在外周血mRNA对乳腺癌诊断的临床应用价值。

1资料与方法

1．1一般资料

选取本院健康女性体检者50例作为健康对照组，年龄21～86岁，平均46．7岁。另选取本院门诊和住院乳腺疾病患者288例，年龄21～87岁，平均45．3岁，经病理学确诊，均为初诊者。其中良性乳腺疾病患者（良性乳腺疾病组）92例，年龄23～79岁，平均43．6岁；脂肪瘤51例，纤维瘤41例，排除患其他肿瘤的可能性。乳腺癌患者（乳腺癌组）196例，平均年龄47．8岁（23～87岁），具体的临床病理学特征见表1。乳腺癌的诊断标准参照《恶性肿瘤TNM分类法》和美国癌症联合委员会（AJCC）标准。所有患者均于手术前1周内取晨血5mL。

1．2试剂与仪器

逆转录反应体系、β－actin内参、FQ－PCR体系、7500SequenceDetector分析仪购自美国ABI公司；cDNA标准品由上海生工公司合成。

1．3方法

1．3．1FQ－PCR引物和探针

采用PE公司PrimerExpress软件设计引物和探针，由上海生工公司合成。BCL－2正义引物5′－ACCCCCACTGAAAAAGATGA－3′，BCL－2反义引物5′－ATCTTCAAACCTCCATGATG－3′；CCND1正义引物5′CCTCCTCGCACTTCTGTTCCTCGCAGACCT－3′，CC－ND1反义引物5′－CCAGCATCCAGGTGGCGACGATCTTCCG－3′；MUC1正义引物5′－CGTCGTGGACATTGATGGTACC－3′，MUC1反义引物5′－GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA－3′；HER－2正义引物5′－GGCTCTCACACTGATAGACACC－3′，HER－2反义引物5′－TCCCCAGCAGCGGGAGCCCTTAC－3′；hMAM正义引物5′－GAGTTCATAGACGACAATGCC－3′，hMAM反义引物5′－CCGTAGTTGGTTTCTCACCAT－3′，β－actin正义引物5′－CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT－3′，β－actin反义引物5′－AGCACTGTGTTGGCGTACAG－3′。

1．3．2FQ－PCR

（1）采用异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法提取细胞总RNA：取静脉血5mL（1mg／mLED－TA抗凝），生理盐水稀释2～3倍，分离淋巴细胞。（2）cDNA合成：逆转录反应体系20μL，其中随机引物200ng，RNasin20U，M－MLV反转录酶20U，5×逆转录反应缓冲液4μL，细胞总RNA1μg。42℃反应50min。（3）PCR：MgCl25mmol／L，反应体系逆转录产物5μL，寡聚核苷酸引物各为400nmol／L，dCTP、dATP和dGTP各200μmol／L，dUTP400μmol／L，10×缓冲液5μL，尿嘧啶N－糖基化酶（UNG）0．5U，探针150nmol／L，TaqDNA聚合酶1．25U。在7500SequenceDetector分析仪上测定标本中CCND1、BCL－2、MUC1、HER－2、hMAM和β－ac－tin含量。扩增参数为：50℃2．5min，95℃12min；94℃30s，66℃1min，42个循环。1．3．3阳性率的计算［7－8］应用2－ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量（Ct为循环阈值）。ΔCt值＝目的基因Ct值－β－actin基因Ct值，以β－actin为内参；ΔΔCt＝乳腺癌组的ΔCt值－健康对照组的ΔCt值健康对照组的基因相对表达量为1．002±0．079，2－ΔΔCt值为乳腺癌组基因相对健康对照组基因表达的倍数，测定值以2－ΔΔCt＞2为表达阳性。

1．4统计学处理

采用SPSS16．0统计软件进行统计分析，各组符合正态分布的计量资料比较采用方差分析，两组间比较用采用LSD－t检验。取检验水准α＝0．05，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1各组5种基因mRNA相对表达水平比较

健康对照组和良性乳腺疾病组间5种基因mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0．05），而乳腺癌组上述指标均高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0．01）。

2．2各组5种基因mRNA阳性表达情况比较

5种基因mRNA在健康对照组和良性乳腺疾病组及乳腺癌组的Ⅰ期的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0．05），而乳腺癌组的Ⅱ期和Ⅲ＋Ⅳ期则显著高于健康对照组和良性乳腺疾病组的阳性表达率，差异有统计学意义（P＜0．01）。2．35种基因mRNA对乳腺癌诊断性能评价5种基因对乳腺癌的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分析结果见表4，综合评价各项指标，HER－2的灵敏度较高，BCL－2的特异性较强。

3讨论

随着对乳腺癌分子水平的深入研究，人们采用各种方法检测不同来源乳腺癌相关基因的表达。比如，应用免疫细胞学法从蛋白质水平进行检测，应用分子生物学方法从组织或外周血进行基因水平（DNA和RNA）检测等。其中FQ－PCR是在常规PCR基础上加入荧光标记探针进行核酸定量分析的先进方法，能同时进行扩增和检测［9］，其具有灵敏度高、特异性较强、操作简单、不需采用强诱变剂等优点，因而被广泛应用于外周血中乳腺癌基因mRNA的检测。BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM是乳腺癌常用的肿瘤标志物，也是近年来报道得较多的乳腺癌相关基因。笔者查阅资料发现，采用FQ－PCR检测乳腺癌mRNA相关基因的报道存在阳性率差别较大的问题［8，10－11］。本研究检测196例乳腺癌患者和92例良性乳腺疾病患者外周血hMAM表达率分别为22．0％和6．0％，而陈月凤等［10］检测47例乳腺癌和45例乳腺良性肿瘤外周血hMAM表达率分别为65．96％和42．22％，颜蕴文等［11］检测40例乳腺癌患者hMAM阳性率55％，OBERMAYR等［12］检测38例乳腺癌复发患者外周血中hMAM基因表达阳性率为38．7％。本研究检测196例乳腺癌外周血MUC1阳性率为21．0％，STRATI等［9］检测51例转移性乳腺癌的外周血MUC1阳性率为45．1％，CHENG等［13］检测34例转移性乳腺癌外周血MUC1mRNA化疗前后的阳性率分别为88．2％和70．6％。本研究检测70例早期乳腺癌外周血HER－2阳性率为8．6％，中晚期阳性率为19．4％，PAGE等［8］在检测68例早期和30例转移乳腺癌外周血HER－2表达阳性率分别为11．8％和16．7％，BECHMANN等［14］检测50例早期乳腺癌患者外周血HER－2的表达阳性率为18．0％，均存在较大的差异。分析原因可能有以下几点［15］：（1）mRNA的水平：在早期乳腺癌外周血中mRNA水平较低，而中晚期乳腺癌mRNA水平才大量升高；（2）mRNA本身的异质性：不同的乳腺癌相关基因定位了mRNA不同基因位点，使得阳性率产生差异；（3）内源性或外源性因素：比如样品保存、分离、提取和cDNA的制备等；（4）缺乏质量控制：目前国内外尚无统一的FQ－PCR检测mRNA的质量控制系统，这也是造成阳性率差异大的主要原因；（5）方法本身的局限性，如假阴性或假阳性。本研究结果发现，BCL－2、CCND1、MUC1、HER－2、hMAM5种基因表达水平在健康对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学意义（P＞0．05），而乳腺癌组均高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0．01）。对五种基因和乳腺癌临床病理因素关系的分析发现，五种基因mRNA在健康对照组和良性乳腺疾病组及乳腺癌组Ⅰ期的阳性表达率差异无统计学意义（P＞0．05），在乳腺癌组中，肿瘤大小、ER、PR和HER－2比较，差异无统计学意义（P＞0．05），Ⅱ期、Ⅲ＋Ⅳ期组和淋巴结转移组显著高于Ⅰ期组和无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P＜0．05），说明级别越高，有淋巴结转移的乳腺癌的基因表达越强烈。综合评价5种基因对乳腺癌的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分析结果，HER－2的灵敏度较高，BCL－2的特异性较强。

4结论

由于本研究所选用的基因和研究样本量的局限，还不能对这5种乳腺癌相关基因在mRNA的表达能否用于乳腺癌的早期诊断和治疗的问题做出肯定或否定的回答，但Ⅱ期显著高于健康对照组和良性乳腺疾病组，说明乳腺癌相关基因检测对中早期乳腺癌诊断还是有一定意义的。本研究通过对5种基因在健康对照组、良性乳腺疾病组和乳腺癌不同病理学阶段阳性率的比较分析，提示当乳腺癌处于中晚期，若能采用严格的实验室质量控制，FQ－PCR检测mRNA可为临床提供具有一定的实验室依据，但对早期乳腺癌的诊断价值，还值得商榷，这与国外的相关报道也是一致的［1，16］。在使用FQ－PCR检测乳腺癌mRNA时，还应考虑到质量控制、mRNA水平和异质性、肿瘤的不同阶段等各个方面的因素，才能有效正确地将乳腺癌相关基因用于乳腺癌的诊断、治疗和预后。

作者：余修中1，欧华1，刘怀莉1，邓君2单位：1．新津县人民医院检验科，2.．四川省医学科学院／四川省人民医院检验科