佐剂性关节炎大鼠骨代谢标志物探讨范文

《广州中医药大学学报》2015年第六期

类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以慢性破环性关节病变为特征的全身性自身免疫病。其基本病理改变为滑膜炎，表现为滑膜的血管增生和炎症细胞浸润以及滑膜炎导致的滑膜、软骨乃至软骨下骨组织的破坏。临床上，以南蛇藤为主要药物组成的断藤益母汤是治疗RA的有效药物，既往实验研究证实其具有抗炎、调节免疫等作用［2］。佐剂性关节炎（AA）大鼠的病理改变与RA具有相似或相近的临床表现、病理、免疫等特点，是研究RA的较理想模型［3］。血清Ⅰ型胶原羧基末端肽（CTX-Ⅰ）是Ⅰ型胶原蛋白的羧基末端降解产物，是骨重吸收标志物。骨Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PⅠNP）反映新合成的Ⅰ型胶原蛋白的变化，是骨形成标志物。这2个指标能较灵敏地反映骨吸收与重建。本研究通过观测单药南蛇藤煎剂、断藤益母汤煎剂、甲氨蝶呤（MTX）对AA病理模型大鼠的关节肿胀度、关节X线评分、血清CTX-Ⅰ、PⅠNP的影响，探讨断藤益母汤对完全弗氏佐剂致敏病理模型大鼠关节骨吸收、重建的作用，为断藤益母汤的组方提供实验依据，现报告如下。

1材料与方法

1．1实验动物SPF级雌性SD大鼠72只，体质量（200±20）g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK粤2013-0092。

1．2药物、试剂与仪器南蛇藤(广州岭南中药饮片有限公司，批号：140301)；益母草(广东省药材公司中药饮片厂，批号：85313711)；续断(康美药业股份有限公司，批号：140107421)；甲氨蝶呤片（上海信谊药厂有限公司，批号：036130706）；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；CTX-Ⅰ酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒及PⅠNPELISA试剂盒（武汉华美公司）；FA204B型电子精密天平(上海皖衡电子仪器有限公司)；680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；PV-200型足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)；EQ.0•5pb/40KY型钼靶机(意大利吉特公司)；LABY01型高速低温离心机(广州天臣实验室有限公司)。

1．3药物的制备与剂量单方和复方的高、中、低剂量组分别给予临床等效剂量换算后的10、5、1倍药量，其中单方为南蛇藤煎剂，复方为断藤益母汤煎剂。单方高、中、低剂量组给药剂量为南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1，复方高、中、低剂量组给予南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1+续断16、8、1.6g•kg-1•d-1+益母草31、15.5、3.1g•kg-1•d-1。煎煮方法：南蛇藤先煎3.5h，加入续断和益母草同煎1h，由广州中医药大学第一附属医院煎药室煎至特定用量，装瓶放置于4℃冰箱中保存备用。MTX组给予MTX片1.06mg/kg，每周1次，溶于生理盐水配至所需用量。

1.4分组、造模与给药将72只SD大鼠随机分为9组，即空白组、模型组、MTX组、单方低剂量组（单低组）、单方中剂量组（单中组）、单方高剂量组（单高组）、复方低剂量组（复低组）、复方中剂量组（复中组）和复方高剂量组（复高组），每组均为8只。适应性喂养3d。参照文献［3］方法，除空白组外，其他组大鼠于右足趾皮下注射完全弗氏佐剂0.15mL。造模当天开始灌胃给药。空白组、模型组给予生理盐水10mL•kg-1•d-1，中药组给予对应中药10mL•kg-1•d-1，MTX组给予MTX水溶液每周10mL•kg-1。给药36d。

1.5关节肿胀的观察采用容积法测量并计算关节肿胀度，关节肿胀度（%）=（注射后所测值-注射前所测值）/注射前所测值×100%。

1.6血清CTX-I、PⅠNP水平检测给药36d后腹主动脉采血，采用ELISA法检测血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平。步骤如下：全血标本离心取上清用样本稀释液1∶20倍稀释后待检；配置标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液；分别设标准品孔、待测样本孔加样；按弃液、甩干、洗版步骤，依次加入生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，然后依序每孔先后加入底物溶液、终止溶液；反应终止后5min内采用酶标仪测量各孔的光密度（D）值；最后用标准品浓度与D值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的D值代入方程式，计算出样本浓度。

1.7踝关节X线片评价取大鼠右足，采用钼靶X线检测，由影像学医生盲法阅片后评分。评分标准采用美国风湿病学会推荐的放射学评分标准［1］。0分：正常；1分：X线检查无破坏性改变，可见骨质疏松；2分：表现骨质疏松，可有轻度软骨破坏，有或没有轻度的软骨下骨质破坏，可见关节活动受限，但无畸形；3分：骨质疏松加上软骨或骨质破坏，关节畸形，无纤维性或骨性强直；4分：纤维性或骨性强直。

1.8统计方法计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。统计软件用SPSS19.0，统计方法采用单因素方差分析，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组足肿胀度表1结果显示：模型组大鼠足肿胀度显著增加，与空白组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，给药36d后，各给药组足肿胀度显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各给药组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2各组踝关节X线片评分表2结果显示：模型组踝关节X线片均出现明显的关节破坏，部分甚至出现纤维性或骨性强直，X线评分与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。各给药组X线评分与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），各给药组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。2.3各组血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平表3结果显示：模型组CTX-Ⅰ水平显著高于空白组（P＜0.05）；MTX组、复方低剂量组可显著降低CTX-Ⅰ水平，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组间PⅠNP水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

本研究造模后AA模型组大鼠关节肿胀度、X线评分均较空白组显著升高（P＜0.05），表明造模成功。各给药组AA大鼠关节肿胀度、X线评分显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），中药组与MTX组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），提示南蛇藤单药煎剂，南蛇藤配伍续断、益母草均能有效抗炎、消肿，减轻骨破坏、保护骨质，其有效程度与MTX相仿，与既往研究结果相符。各中药组大鼠关节肿胀度、X线评分组间呈现一定量效趋势，但差异无统计学意义，可能与观测时间短有关。各组间PⅠNP水平比较差异无统计学意义，分析其原因可能与以下因素有关：PⅠNP较稳定地反映骨形成的水平，能长时间存在于血液循环中。因本研究时间短，PⅠNP未能完全反映各组间骨重建差异。国外文献报道临床观测CTX-Ⅰ水平下降，但PⅠNP指标仍维持稳定，可为之佐证。

模型组CTX-Ⅰ水平显著高于空白组（P＜0.05），与文献报道类风湿关节炎患者的血清CTX-Ⅰ水平与关节破坏严重程度正相关的结论一致。血清CTX-Ⅰ水平对治疗反应敏感，MTX组CTX-Ⅰ水平与空白组比较差异无统计学意义，较好地反映MTX的治疗作用。中药组中除复方低剂量组外，其他各中药组CTX-Ⅰ水平与模型组比较差异均无统计学意义。对大鼠足肿胀度和X线评分的观察结果显示各中药组的治疗作用明确，可控制关节炎症和阻止骨破坏，其效果与MTX相仿。但中药组CTX-Ⅰ水平升高未能反映中药组的治疗作用，分析可能与CTX-Ⅰ并不仅仅单纯受局部关节的骨吸收影响，同时还受全身骨代谢影响有关，可能原因如下：骨吸收标志物CTX-Ⅰ是破骨细胞活动及骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物，反映关节局部及全身骨代谢水平。换言之，CTX-Ⅰ水平除能反映关节骨破坏情况外，同时受全身骨代谢影响。南蛇藤系卫矛科雷公藤属植物，在临床上雷公藤类制剂具有卵巢毒性为人熟知，实验证实雷公藤制剂连续灌胃14~15d即可导致大鼠卵巢早衰。本研究大鼠为雌性大鼠，南蛇藤煎剂喂养36d，较以往文献15d左右造成大鼠卵巢早衰模型时间更长。

另外研究证实卵巢切除后雌性大鼠出现骨吸收伴随骨转换增强，类似于人正常绝经时骨丢失状态。临床研究发现，绝经后女性CTX-Ⅰ水平显著高于绝经前女性。由此分析，中药组（除复低组外）CTX-Ⅰ水平升高，可能因为大鼠全身骨吸收增加对于CTX-Ⅰ水平影响远大于关节局部；模型组与空白组因无全身骨吸收的影响，其CTX-Ⅰ水平可以反映局部关节破坏情况。引起大鼠全身骨吸收增加原因，分析与南蛇藤的卵巢毒性造成大鼠骨吸收增加有关。提示进一步的研究中应采用去势大鼠的方法，避免南蛇藤卵巢毒性对于骨代谢标志物的干扰。断藤益母汤复低组CTX-Ⅰ水平与空白组、MTX组相当，低于中药组内其余各组，提示南蛇藤加入川续断、益母草配伍后对于总骨吸收水平有降低作用，但随南蛇藤浓度提高，其作用消失。类风湿关节炎属痹证范畴，南蛇藤具有祛风胜湿、行气活血、消肿解毒功效，与之合拍；肝主筋、肾主骨，肝肾内虚为痹证内因，故加川续断功效补肝肾、强筋骨；针对南蛇藤的卵巢毒性，加益母草活血调经，利水消肿。既往实验研究发现续断有抑制去卵巢大鼠骨吸收、防治骨质疏松作用，益母草总黄酮可升高去卵巢大鼠血清中雌二醇水平、椎骨骨密度、下丘脑和海马雌激素受体α、βmRNA表达。复低组CTX-Ⅰ水平下降可能与川续断抑制骨吸收，益母草提高雌二醇水平、雌激素受体水平有关。本研究虽然未直接测定大鼠性激素、骨密度等指标，但通过CTX-Ⅰ水平可侧面反映南蛇藤配伍川续断、益母草具有一定减毒作用。复中组、复高组的CTX-Ⅰ水平升高，未显示出川续断、益母草抑制总体骨吸收的量效关系，可能与随着南蛇藤浓度提高其对骨吸收影响占主要有关，其机理有待进一步研究。

综上所述，对于佐剂性关节炎大鼠，南蛇藤单药煎剂、断藤益母汤、甲氨蝶呤均有明确的抗炎、抗骨质破坏作用，三者作用比较差异均无统计学意义。南蛇藤对于雌性AA大鼠CTX-Ⅰ的作用是双向的，既因抗骨质破坏作用降低CTX-Ⅰ浓度，也因卵巢毒性导致骨吸收升高CTX-Ⅰ浓度。加入川续断、益母草组成复方后可降低南蛇藤副作用，但随着南蛇藤剂量的提高，其降低南蛇藤副作用的效果消失。

作者：雷旭杰 张明英 郭丽 林昌松 单位：广州中医药大学第一附属医院风湿病科 广州市荔湾区第二人民医院