靶向毒力发现和鉴定抗念珠菌病药物范文

摘要：白色念珠菌，属于条件性致病真菌，是健康人群正常菌群的一种。目前在真菌病治疗方面存在许多缺点比如医疗药物数量抗真菌的药物毒性的出现等。本文主要涵盖关于白色念珠菌病过程，靶向致病过程的相关分子以及真菌毒力因子等研发新型抗真菌毒力物质的进展。由于白色念珠菌的致病性与丝状化及生物膜的形成息息相关，因此，白色念珠菌丝状化和生物膜形成过程也成为了本文阐述的两大关键点。

关键词：抗真菌；生物膜；白色念珠菌；丝靶向毒力；毒力因子；耐药性

1前言

白色念珠菌是念珠菌病中最常见的致病菌，它可以存在于正常人体中，在正常情况下，早到新生儿时期就以共生体的形式寄生于人体尤其是皮肤、胃肠道(包括口腔)、生殖泌尿道的黏膜表面，一般对人体只有少量甚至不会造成伤害。但是，当机体免疫功能破坏，菌群失调或器官移植、或经污染的器械手术等，会造成各种各样的感染，轻者发生浅表真菌感染，严重者致深部真菌感染甚至会威胁生命。目前的抗真菌类药物严重匮乏且受到严重的宿主毒性和耐药性的限制。由于真菌细胞和人类细胞具有类似的生物学机制，很难找到合适的靶点，因此限制研发新药的进程。与靶向真菌细胞生长过程相比，靶向毒力方式无疑是研发新型抗真菌药物更好的选择。在白色念珠菌中，丝状化和生物膜的形成被认为是两种主要的毒力因子，与念珠菌病的发病机制具有密切的联系。新型抗真菌类物质的成功开发要求科研工作者和临床医生、资金供给者和政府机构以及生物技术和药物公司之间的协调合作。

2念珠菌和念珠菌病

能够导致念珠菌病的因素非常多，包括免疫抑制剂的使用、广谱的抗生素广泛使用、移植、医疗器械相关介入手术、肠外营养、出生时极低的体重、年龄以及艾滋病感染、糖尿病、药物滥用等等。例如，患口咽念珠菌病者最常见的是艾滋病患者，同时，头颈部肿瘤患者持续注射抗生素和皮质激素等免疫抑制剂也频发此病。另外女性阴道念珠菌病(亦称复发性念珠菌阴道炎)也侵袭着大量分娩期的妇女。在美国，系统性念珠菌病的发生率在10万人中，就有约20例(或每年约6万例)，而在高危病人中可以增加到50例。数据显示，仅在过去二十年里，这个数据增加了20倍，而感染者的死亡率在30%~50%之间。

3抗真菌类药物治疗及其耐药性

新型抗真菌类药物的研发极具挑战，因为真菌细胞与人类宿主细胞具有类似的真核生物机制，因此要在真菌细胞内找到一种具有选择性的且对某种真菌具有特异性的靶点是非常困难的，而这恰恰是研发抗真菌类药物所必须的条件。这也是目前一些抗真菌药物具有严重宿主毒性的原因。严格地从临床角度上来讲，目前可用于对抗念珠菌的抗真菌类物质只有三种：多烯类、唑类、棘白菌素类。例如，两性霉素B，一种作用于麦角固醇的广谱多烯类，可破坏膜的完整性。自从19世纪50年代引入后的数十年间，它就一直是抗真菌类治疗的“金标准”，但它的应用被它固有的毒性尤其是肾毒性所限制。唑类，具体来说是三唑类(例如，氟康唑)，这类抗真菌类药物研发于19世纪八九十年代，它可以抑制麦角固醇的合成，然而，一个更大的问题出现了，那就是耐药性(包括对各种各样唑类衍生物的交叉耐药性)。耐药性，大部分是通过靶点酶(羊毛甾醇脱甲基酶)的点突变或者药物外排泵的过表达引起的。同时，跟念珠菌病有很大关联的生物膜的形成会使唑类药物失效，因为在生物膜庇护下的细胞会表现出极强的对唑类抗真菌物质的耐药性（高1000倍）。后来一种新型抗真菌物质也随之研发上市，那就是棘白菌素(例如，卡泊芬净)。这种半合成的脂肽类抗生素可抑制β-1,3-D葡聚糖的合成，而这正是真菌细胞壁的关键组成物质，这是第一种作用于真菌的某一组织而不是哺乳类(也就是宿主)细胞的抗真菌类药物。它们由于自身出色的安全性，因而被加入到抗真菌类物质库后受到极大的欢迎，但是抗药性的出现(主要是因为编码靶点酶FKS1基因的突变)逐渐成为一个亟待解决的问题。另外，遗憾的是，棘白菌素类药物只能通过静脉注射的方式给药，故通常它仅限于治疗严重的念珠菌病。

4靶向毒力：

抗真菌药物发展中未被利用的新领域传统的抗生素通过杀死细胞或者抑制其生长的方式来达到杀菌目的。这些作用机制具有高度的选择压力并最终导致抗真菌药物耐药性的出现。自从青霉素引入临床治疗后，几乎每一种临床使用的抗生素都具有了耐药性，故而研发新型抗生素十分重要。得益于我们人类对微生物发病机制的逐渐了解，一种新型的替代方法诞生了，那就是靶向真菌感染所必需的因素，对宿主造成伤害所需的毒力因子。毒力的定义是指病原体造成明显病症的能力，毒力因子是指能够对宿主的组织器官造成伤害的微生物因子或者过程。靶向毒力主要的优点有：①有利于增加新型抗真菌化合物研发的潜在靶点；②能够保护宿主微生物群；③药物选择性压力低，能够延缓或避免抗生素耐药性的发展。值得考虑的是，各病原体之间的毒力经常是特异的，因此抗毒力药物通常情况下的抗菌谱较窄。在使用抗毒力因子药物之前必须要经精确、快速的诊断，在未经快速精确诊断的情况下使用可能会使念珠菌病情恶化。

5丝状化和生物膜形成是白念珠菌的重要毒力因子，是开发新型抗真菌药物的重要靶标

白色念珠菌作为一种条件性致病菌，其致病性与本身固有的毒力属性和宿主免疫力相关，人们认为白色念珠菌的毒性与胞外水解酶、表型转化、抗原变异性以及分子拟态的产生与发生有关。丝状化和形成生物膜的能力被认为是引起念珠菌病的主要毒力因子。因此，接下来本文将着重论述这两者的生物过程在白色念珠菌感染当中扮演的角色，为靶向此两者研发新型抗治疗念珠菌药物提供依据。

5.1新型抗真菌药物的研发：

靶向白色念珠菌的丝状化白色念珠菌是一种多形态的真菌，并且可以在酵母和丝状形态进行可逆的形态转变。酵母细胞可诱导形成真菌丝，菌丝在根尖连续延伸后隔断生长，而假菌丝则以单极芽的形式生长，芽发育成伸长的细胞，并始终与母细胞相连(图1)。丝状本身代表着毒力的性状，同时它还和其它与细胞形态有关的毒力因子之间存在相互调节的作用。形态转变是应对外界刺激的正常反应，包括体温(37℃)、血清、中性pH、氨基酸、营养物质(例如N-乙酰葡萄糖胺)、微量需氧环境以及特殊的人体激素。从目前的研究来看，这显然是一个复杂而高度精确的过程，因为信号通路可能依赖于单独的或相同的转录因子，而转录因子可能会聚合在共同的靶基因上，从而触发特异性基因的表达。丝状化受正负两方面的调节，白色念珠菌的关键基因与丝状化的正调节有关，包括CPH1、EFG1、HGC1和UME6，这些基因由多种宿主环境信号诱导参与菌丝的延伸。丝状化的负调节主要依靠白色念珠菌的通用阻遏分子，TUP1。此外，含有锌指结构域的DNA结合蛋白CaNr1p可以与Tup1p一起作为丝状化的负调节因子。这些可逆性的形态转变有助于疾病的建立和发展。虽然酵母细胞能有效地散布到全身，但丝状形态的细胞更容易穿透和破坏组织，最终导致宿主死亡。早期的实验证明了丝状化在白色念珠菌毒力中的主要作用：△efg1或△efg1/△cph1基因突变菌株不能形成丝状体，并且在散播性念珠菌病的小鼠模型中表现出毒力减弱。在这些菌株中，形态转变可以很容易在动物体内实现，使用白色念珠菌tet-UME6和tet-NRG1菌株，既证明了与丝状化增加有关的毒力增加，也证明了当感染组织中破坏菌株丝状形成时其死亡率降低(100%存活)。这些研究结果表明抑制丝状化形成是研发新型抗真菌药物的有效靶点。大量的小分子化合物参与调节形态转换，抑制丝状化，调控白色念珠菌由酵母形态向菌丝形态转变。这些化合物包括细菌和真菌调控因子(如铜绿假单胞菌中的吩嗪化合物和高丝氨酸内酯、变形链球菌中的突变抗菌素和由酿酒酵母分泌的癸酸)，由白色念珠菌自身产生的群体感应分子法尼醇和其他自调节醇。Johnson课题组鉴定了多达21种不同的白色念珠菌丝状化抑制剂，并随后证明其中一些抑制剂通过不同信号转导途径发挥作用。需要注意的是，大部分的研究都是在体外进行的，目前仍缺乏证据证明这些化合物在体内的作用。此外这些化合物作为抗真菌药物的药理活性以及毒副作用尚不清楚。在少数情况下，一些化合物在体内进行了测试，迄今为止大多测试或效果颇微，或各种研究结果相矛盾。例如，外源性使用法尼醇，此药在体外可阻止白色念珠菌酵母转化为菌丝，而在感染念珠菌病的小鼠模型中却出乎意料地增加了毒性；另一方面，小鼠腹腔注射模拟白色念珠菌培养上清液中醇成分的鸡尾酒溶液(含法尼醇)显示，在类似的念珠菌病感染模型中，小鼠存活率增加，器官中损伤减少。抑制白色念珠菌丝状化的另一个优点是调节宿主免疫反应，这对解决感染至关重要。免疫系统的不同细胞(尤其是树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)和上皮细胞，它们以不同的方式感知酵母和丝状细胞，导致诱导了不同的先天性和适应性免疫反应。一般来说，如果暴露的是酵母菌形态的细胞，会产生保护性免疫反应，反之如果是丝状形态的细胞，则会产生非保护性免疫反应，甚至直接致病，例如，黏膜上皮细胞能够区分酵母菌和丝状形态的细胞，而炎症反应的加剧与白色念珠菌丝状形成有关，从而导致阴道和口腔念珠菌病的发生。全身层面上而言，丝状化对逃避吞噬细胞和机体免疫来说至关重要，从而触发急性期反应，这将导致对宿主有害的过度炎症反应。因此，抗丝状化合物治疗，可通过调节免疫反应对宿主产生有益的影响。事实上，从免疫学的角度来看，使用抗毒化合物治疗效果，与使用减毒活疫苗时观察到的情况是非常相似的。

5.2抗真菌药物的开发：

靶向白色念珠菌生物膜形成许多微生物在它们的自然栖息地中是附着在膜表面，而非自由漂浮的，因此生物膜成为了现代微生物学发展的典范之一。生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。生物膜细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强。真菌在感染部位可通过形成生物膜为自身提供安全的庇护所来延长感染时间，从而侵入新的感染位点，并抵制宿主的清除作用。据估计，有60~80%的人类感染都与生物膜形成有关。白色念珠菌是最常见的与生物膜形成有关的真菌，而实际上，在过去几十年里，念珠菌病感染率增加与各种医疗植入设备(如支架、分流器、假肢、植入物、气管内导管、起搏器以及各类导管)的使用率增加几乎是持平的，并且主要集中在自身免疫防御能力受损人群。值得一提的是，酵母(主要是白色念珠菌)是导致导液管相关感染的第三大病菌，导液管相关念珠菌病的研究明确表明，血管导管的保留与真菌血症的延长、抗真菌治疗的高失败率、转移并发症风险增加及死亡有关，其他症状诸如口咽念珠菌病、义齿性口炎，甚至阴道念珠菌病，也与白色念珠菌有关。从临床的角度来看，白色念珠菌生物膜最显著的特点是对传统抗真菌治疗具有较高的耐药性。一些研究已经明确地证明，念珠菌生物膜导致对它大多数临床使用的抗真菌药物，特别是唑类和多烯类药物的抗药性显著增加，其结果是念珠菌生物膜对这些病人的健康造成不利影响。白色念珠菌生物膜的形成是一个动态复杂的多级过程，这包括最初的细胞黏附，紧接着细胞分裂、增殖及生物膜成熟，产生细胞外基质。此后，细胞从生物膜中分离出来，这代表着分离的微生物将返回最初浮游的生长模式，从而附着在新的表面，完成生物膜的整个生命周期。丝状化及细胞与细胞之间的信息交流(即群体感应)在白念珠菌生物膜的形成过程中起着极其关键的作用，与丝状化相似，生物膜的生长是对不同环境的不同反应，并在分子水平上受复杂的调控网络控制。目前在医学和经济上对新型抗生物膜相关感染和治疗策略的迫切需求，主要表现在预防性(即抑制生物膜形成)和治疗性(即针对已经形成的生物膜)两方面，而这些策略不仅可能与抑制白色念珠菌生物膜生长的生物材料、导管涂层及锁定液(即在导管内局部使用极高浓度的抗真菌药物)，还会发现能对抗生物膜内细胞的新型活性分子。该领域的研究十分活跃，通过各种天然产物抗生物膜活性的检测以及不同药物库中小分子化合物的筛选，检测到一些活性化合物，包括钙调神经磷酸酶抑制剂(如环孢菌素A，FK506)和hsp90抑制剂(如格尔德霉素)具有抗生物膜活性，且与唑类联用对抑制白色念珠菌生物膜的形成表现出协同作用，增强了棘白菌素对烟曲霉的活性。另外，研究表明脱氧核糖核酸酶可部分提高抗真菌药物的抗生物膜活性。另一种可能的途径是在导管相关的生物膜感染的情况下，靶向细胞的散播，因为分布在生物膜上的细胞负责位于末梢的深层次念珠菌病的散播、渗入以及建立。值得注意的是，由于丝状体和生物膜之间的密切联系，调节白色念珠菌形态转变的药物也有抑制生物膜发育的可能性。抗真菌药新型抗生素研发的主要瓶颈之一是，传统的微生物培养技术与现代新药研发(高通量药物筛选，HTS)及其“求速”为主导的理念相矛盾。因此，为了克服这一障碍，Srinivasan等人近期提出一种基于高通量微阵列的白色念珠菌生物膜技术，其成果为一种名为CaBChip的芯片(白色念珠菌生物膜片)。该芯片由768个空间上不同的纳米生物膜组成，将其放置在标准显微镜载玻片上后测得每层生物膜的体积约为50nL。尽管其微型化程度接近2000倍，但CaBChip芯片上的纳米生物膜表现出的表型特征(即形态和结构特征以及增加的耐药性)能与传统的96孔微量滴定板模型形成的生物膜相当。该纳米生物膜芯片具有快速、强大的处理能力，易于自动化，并且与标准微阵列技术和设备完全兼容。此外，它还减少了体力劳动，减少了试剂的使用，大大降低了实验成本。因此，这种白色念珠菌生物膜技术，真正意义上能做到HTS可用于新型抗生物膜药物研发上，能够迅速、简便、廉价且能同时筛选千百种化合物，加速抗真菌药物研发进程。

6展望

靶向毒力是研发新型抗真菌药物极佳的替代选择，它具有全新的作用机制，单独用药，也能够与抗真菌药物联合用药。靶向丝状化和生物膜形成是研发治疗念珠菌病的新型抗毒力方法。虽然在分子层面上人们不断加深对白色念珠菌的认知，仍然是一项十分困难的任务。与杀死病原体或阻遏其生长相比，靶向与感染发病机制相关的毒力是开发新型抗真菌药物的另一种极具研究前途并且更有效的途径。对于念珠菌病尤其是白色念珠菌而言，应通过增加对其致病机理了解来促进这一工作。在过去的十年里，白色念珠菌基因组测序项目的完成以及进入到后基因组时代，彻底改变了微生物的基础生物学研究。从比较基因组学和功能基因组学及大规模突变体的产生，到蛋白质组学，以及全新的、有效的分子方法分析白色念珠菌的生物学性质和致病性，念珠菌病进入了“分子生物学的爆发”的时代。与此同时，念珠菌病的感染率、发病率和死亡率持续上升。因此，在念珠菌病研究中，新型抗真菌药物的研发仍是一项极具挑战的工作。事实上在近几十年来，唯一一种新型抗真菌药物是棘白菌素，它是制药公司用传统筛选方法从土壤微生物中筛选出的天然产物。由于丝状化和生物膜形成与念珠菌病的发病机制有着不可分割的联系以及靶向这两个过程使新药具有良好的前景。这是两个非常活跃的研究领域，全球有数百个小组在研究这些生物过程。希望通过努力能在不久的将来研发出新型抗真菌药物以增加或补充当前的抗真菌药物库。

作者：詹洪洪 单位：西南大学药学院