精芪燕面方对大鼠血压升高干预分析范文

摘要:目的探讨精芪燕面方(JQYM)对自发性高血压大鼠(SHR)血压升高及心肌损伤的干预效果,为药食同源的中药组方防治高血压的临床应用提供理论和实验依据。方法采用SHR雄性大鼠作为高血压动物模型,分为SHR模型组、JQYM组、坎地沙坦酯片组(Can组),以同周龄同源WistarKyoto(WKY)雄性大鼠为正常对照组,每组各12只。各组大鼠从6周龄起开始治疗干预14周,于20周龄分析血压、旋转耐受时间、心脏组织病理改变及肿瘤坏死因子α(TNFα)、钠尿肽(ANP)基因的mRNA表达水平。结果与正常对照组比较,SHR模型组收缩压及舒张压随着周龄变化显著升高;与SHR模型组比较,JQYM组SHR大鼠收缩压及舒张压水平显著降低(P<0.05)。与SHR模型组比较,JQYM组旋转耐受时间显著延长(P<0.05)。与SHR模型组比较,JQYM组及Can组心肌损伤程度显著减轻(P<0.05)。与SHR模型组比较,Can组及JQYM组心肌细胞横截面面积缩小,且JQYM组优于Can组(P<0.05)。与SHR模型组比较,Can组及JQYM组TNFα及ANPmRNA表达水平显著降低,且JQYM组较Can组降低明显(P<0.05)。结论JQYM干预能够显著降低SHR大鼠收缩压及舒张压水平,延长旋转耐受时间,减轻高血压相关心肌损伤及心肌细胞肥大样改变,降低心脏组织中TNFα及ANPmRNA的表达水平。JQYM具有显著的抗SHR大鼠血压升高的效应,同时对高血压相关心肌损伤及心肌细胞肥大等病理改变具有显著的干预效应。

关键词:高血压;精芪燕面方;心肌损伤;心肌保护作用;自发性高血压大鼠

高血压(hypertension)是以体循环动脉压增高为主要表现,可伴有心、脑、肾等器官功能或器质性损害的临床综合征,在临床上有高致残率和高致死率的特点[1]。而收缩压/舒张压(SBP/DBP)每降低10/5mmHg(1mmHg=0.133kPa)可显著减少所有主要心血管结局的相对风险[2]。2017年11月14日美国心脏病学会(ACC)和美国心脏协会(AHA)联合2017版高血压临床实践指南,提出将高血压的诊断从140/90mmHg下降至130/80mmHg,将目标血压降低病人的获益将增大[3]。目前降压药物主要为5大类,但因多方面原因,高血压控制率仍处于较低水平,患病率仍在持续上升[4]。高血压的早期防治和长期防治战略得到了学术界的共识,中医药作为辅助药物治疗高血压,在调节机体整体平衡、控制血压水平稳定等方面体现出独特的优势[5],在平稳降压的同时,能够有效改善眩晕、头痛等临床症状,并减少并发症的发生,同时长期防治中药物的副作用也是一个主要的障碍,因此药食同源中药研究是应对高血压长期防治的优势途径,目前中医临床探索较多,但深入细致的研究缺乏。作为药食同源的中医药处方,有潜在心肌保护作用。本研究选择自发性高血压大鼠(spontaneouslyhyperten-siverats,SHR),观察精芪燕面方(JQYM)在降低SHR血压的同时,对行为学表现(旋转耐受时间)及心脏组织肿瘤坏死因子α(TNFα)、钠尿肽(ANP)mRNA表达水平及心肌损伤的影响。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级4周龄SHR和WistarKyo-to(WKY)雄性大鼠,购自北京维通利华有限公司。

1.2药物与试剂

精芪燕面方所含中药材购自上海康桥中药饮片有限公司:夏枯草(批号161114)、黄芪(批号161207)、制黄精(批号161201)、桑叶(批号161101)、生山楂(批号161022);坎地沙坦酯片(8mg):国药准字J20150085,日本武田药品工业株式会社生产。逆转录试剂盒:日本Takara,宝生物工程(大连)有限公司生产;SYBRGreen荧光染料:瑞士Roche公司生产。

1.3主要仪器

智能无创血压计BP98ASeries[北京软隆(Softron)生物技术有限公司];平衡旋转仪(JD01GSZ型,上海继德教学实验器材厂);自动脱水机,石蜡包埋机,石蜡切片机及正置显微镜(LEICA);PCR定量测试仪(Eppendorf);实时荧光定量PCR系统(LightCyclerRL480IIRoche)。

1.4实验方法

1.4.1实验分组采用4周龄SHR雄性大鼠36只为实验动物,适应性饲养1周后,随机分为SHR模型组,中药治疗组(JQYM组)、坎地沙坦酯片组(Can组),每组各12只。以同周龄WKY雄性大鼠12只为正常对照组。所有动物均饲养于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物实验中心,并均给予标准化饮食,不限其活动,维持其饲养温度及相对湿度以保证饲养环境。1.4.2给药方式及剂量JQYM组、Can组于6周龄时分别灌服精芪燕面方、坎地沙坦酯片;SHR模型组与正常对照组则灌胃等剂量的饮用水。所有实验动物饲养至20周龄。Can组所用坎地沙坦酯采用pH值为6.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解,按照人体剂量换算以1mg/kg的剂量灌胃,每次2mL,每日1次;JQYM组大鼠用量按人体用量6.3倍换算给药,称取相应草药(夏枯草30g,黄芪30g,制黄精15g,桑叶15g,生山楂15g),使用自动煎药锅进行煎煮,煎煮后取药汁,按每只大鼠灌胃2mL计算所需药汁总量,进行加热浓缩定量。1.4.3血压测量所有实验动物每2周测量其收缩压及舒张压水平。所有待测血压动物,当日09:00灌胃,测量灌胃后1h血压。测量过程完全严格按血压计操作手册规范进行操作,首先将测量装置连接好并开启保温装置,温度控制在37.0℃~38.5℃。然后将大鼠放在保温装置中固定并预热约15min后,开始测量大鼠安静清醒状态尾动脉收缩压,连续测量3次取其平均值,正式测量血压之前每天进行测量血压训练,连续训练7d[6]。1.4.4旋转耐受时间测量对大鼠的平衡耐受时间进行测量,把大鼠安置在转速为60r/min的旋转平台之上,观察大鼠自旋转到跌落平台的时间并进行记录,2min后,若大鼠仍然在平台上,就停止测试,所有大鼠的测试时间统一规定在10:00~11:00。观察大鼠掉落平台时间来判断大鼠的旋转耐受时间。1.4.5心脏组织苏木素伊红(HE)染色所有实验动物均于最后一次灌胃测压后,次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉,解剖取材。每组随机选取6只大鼠,取心脏组织,用4%多聚甲醛固定,24h后自动脱水机脱水、石蜡包埋。主要采用石蜡切片,HE染色,显微镜下观察病理形态的变化。大鼠心脏病理切片,每隔10张选取1张进行HE染色,显微拍摄,评分。1.4.6心肌细胞肥大评价每只动物每张病理切片,选择病变部位附近30个~50个心肌细胞,使用LeicaQwinV3分析软件计算每个心肌细胞的横截面积,取其平均值以代表该实验动物的心肌细胞横截面面积,并进行统计学分析。1.4.7RNA抽提及TNFα、ANP表达检测每组取6只大鼠心脏组织靠近心尖部下1/3予以检测TNFα及ANPmRNA相对表达。βactin作为内参,βactin引物:上游5′CACCCGCGAGTACAACCTTC3′,下游5′CCCATACCCACCATCACACC3′;TNFa引物:上游5′ACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAAT3′,下游5′CTTGTCACTCGAGTTTTGAGAAGA3′;ANP引物:上游5′CTGGGACCCCTCCGATAGAT3′,下游5′TTCGGTACCGGAAGCTGTTG3′。1.5统计学处理运用SPSS18.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,使用单因素方差(onewayANOVA)分析,组间比较采用LSD方法。采用非参数检验对有序分类资料各组心肌损伤评分进行Ridit分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠收缩压变化情况

与正常对照组比较,SHR模型组收缩压随着周龄的增加,其收缩压持续上升。与SHR模型组比较,Can组收缩压显著降低(P<0.05)。与SHR模型组比较,JQYM组灌胃4周后(8周龄)开始有显著降压作用,一直到20周龄,持续稳定发挥控压作用(P<0.05)。详见表1。

2.2各组大鼠舒张压变化情况

与正常对照组比较,SHR模型组舒张压显著升高。与SHR模型组比较,Can组舒张压水平显著降低(P<0.05);JQYM组于第14周龄、18周龄、20周龄时,舒张压水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。2.3各组大鼠旋转耐受时间比较与正常对照组比较,SHR模型组旋转耐受时间缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。Can组旋转耐受时间与SHR模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。JQYM组旋转耐受时间较SHR模型组、Can组显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

2.4各组大鼠心肌损伤程度比较

高倍镜下,正常对照组心肌组织未见明显病理性改变;SHR模型组可见心肌组织多发性灶性坏死,大量炎性细胞浸润;JQYM组仅见少量的炎性细胞浸润,且对心肌组织的保护作用优于SHR模型组。详见图2。根据心肌损伤受累面积、损伤程度等,分别标记为“-”“-/+”“+”“++”“+++”“++++”,其中“-”代表无明显损伤,“++++”则为存在极重度损伤。与SHR模型组比较,JQYM组与Can组心肌损伤程度显著降低(P<0.05)。详见表3。

2.5各组大鼠心肌细胞横截面面积比较

为进一步探索JQYM对高血压心脏保护效应的研究,在高倍镜下分别选取30个~50个心肌细胞,使用LeicaQwinV3分析软件计算每个心肌细胞的横截面积,进行统计分析。与正常对照组比较,SHR模型组大鼠心肌组织平均横截面面积显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与SHR模型组比较,Can组及JQYM组心肌横截面面积显著降低(P<0.05),且JQYM组较Can组降低更明显(P<0.05)。详见图3、图4。各组大鼠心肌细胞横截面面积比较2.6各组大鼠心脏组织TNFα及ANPmRNA表达水平比较分别将正常对照组大鼠心脏组织中TNFα及ANPmRNA表达量标准化为1。与正常对照组比较,SHR模型组大鼠心脏组织中TNFα及ANPmRNA相对表达量均显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与SHR模型组比较,Can组和JQYM组心脏组织中TNFα及ANPmRNA相对表达量均显著下调(P<0.05);且JQYM组较Can组TNFα及ANPmRNA表达降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图5、图6。与SHR模型组比较,*P<0.05;与正常对照组比较,#P<0.05;JQYM组与Can组比较,△P<0.05图5各组大鼠心脏组织TNFαmRNA表达水平比较

3讨论

高血压属于中医学“眩晕”“头痛”等病证范畴,张腾教授认为早中期高血压病变主要在肝,治疗应注重随证从肝论治,重在清肝益肾祛风,通过在临床长期治疗大量高血压病总结出该法则有效。本研究在前期临床及动物实验结果得出清肝益肾祛风法则组合的方药不仅能降低血压,而且能够保护心、脑、肾靶器官损伤,改善临床症状,提高生活质量,取得较好的临床效果[78]。本课题组为进一步推广中医药防治高血压病,以清肝益肾祛风为组方精髓,选择药食同源的中药组合成精芪燕面方(夏枯草30g,黄芪30g,制黄精15g,桑叶15g,生山楂15g)。夏枯草又名燕面(《别录》),具有清肝火明目[9];黄芪与制黄精益气养阴益肾[1011];桑叶辅助祛风清肝[12];生山楂消食健胃,行气散瘀[13],诸药组合为药食同源方并选择自发性高血压大鼠进行动物实验以期获得更充实的数据为其推广和应用奠定基础。SHR是目前国际公认最接近于人类原发性高血压的动物模型,是基础研究及药物筛选的首选[14]。除了血压值指标外,本研究纳入旋转耐受时间这一指标。通过实验研究提示精芪燕面方能显著延长旋转耐受时间,且显著优于坎地沙坦,在证实了其稳定的降压作用基础上又突显了中药改善症状的优势作用。TNFα是一种促炎性细胞因子,主要由巨噬细胞、CD4淋巴细胞、自然杀伤细胞激活,可促进白介素1(IL1)和白介素6(IL6)的释放,加重高血压进展。本研究发现JQYM可显著降低SHR大鼠心肌组织中TNFα水平,提示JQYM降压的作用可能与降低心肌组织中TNFα的水平,进而改善炎症水平有关。ANP是一类由心房肌细胞合成、释放,在正常生理情况下处于低表达状态的肽类激素。在病理情况下,或因机械损伤或因高血压容量状态下,心房肌释放ANP增加。本研究结果显示,JQYM降低SHR大鼠心脏组织中ANP表达,可能与其显著改善心肌损伤的作用有关。综上所述,JQYM对SHR大鼠有显著降压作用,虽然降压水平不及坎地沙坦酯片,但作用稳定持久,且其对SHR大鼠所致的心肌损伤保护作用优于坎地沙坦酯片。高血压及其靶器官损伤是危害人类健康的最主要隐形杀手,防治工作具有长期性、持久性,药食同源处方以其安全第一且作用稳定的巨大优势一定会发挥其积极作用,为人类健康事业做出贡献。

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作者：唐晓婷 唐新淼 崔金刚 杜霄烨 陈瑜 张腾 单位：上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院