食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响范文

《生态科学杂志》2015年第六期

【摘要】

在标准化的大型溞繁殖试验中探讨食物浓度的合适表征指标和研究不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响。结果表明:分别采用细胞计数法、光密度法和总有机碳分析法测定的斜生栅藻液细胞数量、吸光度和总有机碳浓度三者两两之间的线性方程相关系数r均大于0.917(P<0.01),线性相关性显著,三个指标有明显的可比性。从操作的角度考虑,光密度法最为简便,然而为体现不同种类食物提供的能量水平差异,以总有机碳浓度表征食物的浓度最为合适。幼溞的数量是反映亲溞繁殖能力的主要指标,设置的0.01、0.05、0.10、0.15、0.20和0.30mgC•(溞•d)–1食物浓度组所产幼溞数量的平均值和标准差分别为33、6810、11816、16415、20522和23120,表明随着食物浓度的增加,亲溞繁殖幼溞的数量也相应增加,且在不同食物浓度组之间均存在显著性的差异(P<0.05)。当喂食浓度达到0.05mgC•(溞•d)–1时,亲溞繁殖幼溞数量的平均值即能达到60只(大型溞繁殖试验的质量控制要求之一),因此,对于易吸附于藻细胞或被藻细胞降解的化学物质,大型溞繁殖试验中可调整食物浓度为0.05—0.1mgC•(溞•d)–1,有利于受试物暴露浓度的维持。

关键词：

大型溞;斜生栅藻;食物浓度;生长;繁殖

1前言

大型溞(Daphniamagna)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳动物纲(Crustacea),在世界范围分布广泛[1],处在水生生态系统食物链的第二级(初级消费者),具有重要的生态学地位。大型溞体形小、易于实验操作和繁殖、全年可获得,主要以孤雌生殖方式进行繁殖,易于得到基因型一致的单克隆个体,对有毒物质敏感性高[2],被作为标准测试生物广泛应用于有毒物质在生态毒理学上的急性和慢性毒性研究[3]。标准化的大型溞繁殖试验测试结果是欧盟REACH(Registration,Evaluation,Authization,andRestrictionofChemicals)法规中产量超过10吨•年1的化学品必需提供的慢性毒性数据,也是我国新化学物质注册登记中二级及以上申报应提交的慢性毒性数据。经济合作与发展组织(ganizationfEconomicCo–operationandDevelopment,OECD)经过一系列的对比试验,在1998年更新的化学品测试指南-大型溞繁殖试验导则(OECD211)中推荐使用经过基因型鉴定的大型溞品系(如来源于法国IRCHA的品系A)作为受试生物,且要求在0.1—0.2mgC•(溞•d)–1的食物浓度下,需满足试验期间空白对照组存活亲溞所产幼溞的平均值不少于60只的质量控制要求[4]。上述内容,尽管经过2008年至2012年的多次改版更新也一直维持不变[5–6]。

为大型溞提供碳源的食物通常为淡水藻类细胞,如小球藻(Chlellasp.)、羊角月牙藻(Selenatrumcapricnutum)和栅藻(Scenedesumssubspicatus)[6–7]。食物浓度是影响溞类繁殖的重要因素之一[8–9],在适当的食物浓度范围内,提供的食物浓度越高亲溞产幼溞的数量就越多[8,10],更容易满足空白对照组亲溞所产幼溞数量的质控要求。但是在化学品测试中,藻细胞可吸附某些化学物质甚至对化学物质具有降解性[11–16],过高的食物浓度将导致受试物暴露浓度下降,无法在试验期间维持稳定。此外,高浓度的食物也会使试验溶液变得浑浊、减少了亲溞的活动空间,可能会影响亲溞的生长和繁殖。本研究以分离自中国本土水生环境的大型溞作为受试生物,通过设计一组不同食物浓度水平的试验,考察不同食物浓度组中大型溞的生长和繁殖情况,并将其与质控要求进行对比,对标准推荐的食物浓度范围进行验证和优化。过去,国内外大型溞繁殖的相关研究中大多以细胞数量•mL–1表示食物浓度[17–21],而OECD、ISO和国内的化学品测试方法[6,22–23]中,大型溞繁殖试验均要求以mgC•(溞•d)–1来表示食物浓度。因此,为了提高来自不同地区和实验室的研究数据的可比性,提高风险评估时数据的可利用性,本研究对国内广泛采用作食物的斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)液的细胞数量、吸光度和总有机碳(TOC)浓度之间的相互关系也作出有意义的探讨。

2材料和方法

2.1供试生物大型溞(Daphniamagna),引自沈阳化工研究院安全评价中心,分离于国内的水生环境。大型溞在实验室进行长期的培养和繁殖,试验前,在试验条件下驯养了3代以上。驯养过程中,采用ElendtM4培养基,每周更换3次,并投以浓缩的斜生栅藻液作为食物。选择出生小于24h的幼溞作为试验的亲溞用于试验。

2.2食物斜生栅藻(Scenedesmusobliquus),购自中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库。在经过灭菌的OECD201培养基[11]中接入斜生栅藻种,在23℃±2℃、约5000lx连续光照的条件下培养,收集处于对数生长期或稳定期的藻液,经过8000r•min–1离心5min,收集藻细胞,再用去离子水悬浮,定量投喂于大型溞驯养容器中。

2.3试验用水试验用水为OECD、ISO和国内的化学品测试方法[6,22–23]推荐的ElendtM4培养基。pH值范围在7.59—8.65之间、总硬度(以CaCO3计)范围在220—270mg•L–1之间、溶解氧浓度范围在9.0—9.7mg•L–1之间。

2.4试验条件温度:20℃±1℃;光照周期:16h光照/8h黑暗;光照强度:600lx—1200lx;承载量为1只亲溞•80mL培养基–1。

2.5藻液中细胞数量、吸光值与总有机碳(TOC)的测定方法离心收集获得的藻细胞,加入去离子水悬浮和洗涤2—3次,最后加入适量的去离子水悬浮得到藻细胞浓缩液。用去离子水稀释藻细胞浓缩液,得到5个不同稀释倍数的藻细胞稀释液,标记为1—5。以去离子水调零,采用T6紫外–可见分光光度计测定各样品在波长440nm下的吸光值和采用LiquiTOCⅡ型总有机碳/总氮分析仪测定各样品的TOC浓度,同时,在光学显微镜下对各样品中藻细胞的数量进行计数。

2.6大型溞繁殖试验方法依据OECD、ISO和国内的化学品测试方法的大型溞繁殖试验方法[6,22–23],试验设置6个食物浓度组,分别为T10.01mgC•(溞•d)–1、T20.05mgC•(溞•d)–1、T30.10mgC•(溞•d)–1、T40.15mgC•(溞•d)–1、T50.20mgC•(溞•d)–1和T60.30mgC•(溞•d)–1。每个食物浓度组设置10个平行(容器),每个平行含1只亲溞和80mLElendtM4培养基。试验期间,各食物浓度组每天投喂相应浓度的藻细胞浓缩液,每2天更新一次ElendtM4培养基。试验期间,每天观察亲溞的外观和存活情况,及时移除产生的幼溞并计算存活幼溞的数量,记录亲溞的死亡率、所产幼溞的数量、初次生殖时间和总生殖胎数。试验结束时,测定所有存活亲溞的体长。

2.7数据处理采用OfficeExcel2007软件进行线性回归的分析。采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析和多重比较(LSD法),统计显著水平设定为P<0.05。

3结果

3.1藻液细胞数量、吸光度与总有机碳(TOC)浓度之间的线性关系分析结果见表1和表2。各线性方程的相关系数r均大于0.917(P<0.01),说明采用细胞计数法、光密度法和总有机碳分析法测定的藻液细胞数量、吸光度和总有机碳浓度之间的线性相关性极显著,三种测定结果有明显的可比性。

3.2大型溞繁殖试验结果

3.2.1亲溞的死亡率试验结果见表3。各组亲溞的死亡率均满足≤20%的试验有效性要求。经过Cochran–Armitage趋势检验,结果显示,各组的亲溞死亡率不遵循浓度–效应模型,也就是说在0.01—0.30mgC•(溞•d)–1的食物浓度范围对亲溞的死亡并无造成显著影响[6]。可判断T1和T5组的亲溞死亡为偶然因素引起的,因此,在亲溞所产存活幼溞数量的结果分析中排除死亡亲溞所产的幼溞数[6]。

3.2.2存活亲溞的体长试验结果见表3和图1。经方差分析和多重比较(LSD法),表明除了T5与T6组之间存活亲溞体长的平均值无显著性差异(P>0.05)之外,其余各组之间存活亲溞体长的平均值均存在显著性差异(P<0.05)。说明食物的浓度也可显著地影响大型溞的体长增长。

3.2.3亲溞所产幼溞的数量试验结果见表3和图2。试验期间,各组亲溞所产幼溞都没有出现死亡的现象。经方差分析和多重比较(LSD法),结果表明,各组所产幼溞的数量之间均存在显著性差异(P<0.05)。说明在本研究的食物浓度范围内,随着食物浓度的增加,亲溞繁殖幼溞的数量也相应增加。当喂食浓度达到0.05mgC•(溞•d)–1时,亲溞繁殖幼溞数量的平均值即能达到大于60只。另外,除了T1组,其它组亲溞所产幼溞数量的平均值的变异系数范围为8.4%—13.8%,均小于25%,说明整个试验体系的运行良好[6,23]。

3.2.4亲溞的体色、初次生殖时间和总生殖胎数试验结果见表3。为了让低食物浓度组(如T2)亲溞的总繁殖胎数尽可能达到5胎,试验延长了1天,总试验天数为22天。试验期间,T1组亲溞体色变白,生长缓慢,怀卵量少或不怀卵,表明食物严重缺乏导致大型溞的代谢、生长和生殖异常[24–25],而T2–6组亲溞的体色均正常。同时,T1组亲溞的初次生殖时间和总生殖胎数与T2–6组相比存在显著性差异(P<0.05),但是,T2–6组亲溞的初次生殖时间和总生殖胎数之间无显著性差异(P>0.05)。说明当食物浓度低于0.05mgC•(溞•d)–1可能会显著延迟大型溞的生殖时间间隔[24]。

4讨论

4.1食物浓度的合适表征指标和定量分析方法基于生态系统的能量流动理论[26],在大型溞繁殖试验体系中,大型溞的繁殖能力与试验体系中的能量输入直接相关,也就是说食物提供的能量决定了大型溞的繁殖能力。细胞计数法是藻类生物量的基本测定方法,是确定其它测定方法是否有效的依据[27–28]。但是,不同藻种的细胞大小不同,营养组成和含量也会存在差异[29],因此,细胞数量并不能准确表征不同种类食物的能量差异[30]。藻液的总有机碳浓度被认为是表征藻液能量水平差异的合适指标[7,30]。藻液的总有机碳浓度测定需要较高的成本和消耗较长的时间。在本研究中,斜生栅藻液不同稀释倍数的稀释液中的细胞数量、吸光度和总有机碳浓度三者两两之间的线性方程具有良好的线性相关性,表明可用细胞计数法和光密度法准确、间接地测定藻液的总有机碳浓度。但是,细胞计数法易受人为因素的影响,且在细胞密度过低或过高时误差较大,相比较而言,光密度法比细胞计数法更为简便、准确和高效,这与孙欣、黄美玲研究的结论是一致的[27–28]。另外,由于不同藻种的细胞形状、大小不同,营养组成和含量也会存在差异[29],因此,不同藻液的细胞数量或吸光度与总有机碳浓度的线性方程也应该会不同[30]。根据本研究中斜生栅藻的细胞数量与总有机碳浓度之间的线性方程,可以比较同样以斜生栅藻为食物的大型溞慢性毒性研究之间由于食物浓度的不同而带来的差异。如熊勤犁等以每天投放浓度为90000个•mL–1的斜生栅藻[以方程Y=0.2638X+1.8383计算,相当于0.33mgC•(溞•d)–1的食物浓度]研究大型溞的慢性毒性,空白对照组每只亲溞产幼溞数量的平均值和标准差为161±19[31],与本研究结果存在有一定的差异,可能与试验条件不完全相同或者采用的溞种基因型存在差异相关[32]。

4.2食物浓度与大型溞的生长和繁殖的关系

4.2.1不同食物浓度对大型溞体长的影响本研究表明,随着食物浓度的增加,大型溞的体长也相应地增长[24–25]。但是,当食物物浓度达到0.2mgC•(溞•d)–1时,大型溞的体长就基本达到最大值4.26mm左右,此时,即使再提高食物浓度也不会使其体长显著增长。此结果,与罗晓霞和刘正文研究的在同一个100mL试验体系中以食物浓度范围为0.25—20mgC•L–1【相当于0.0025—0.20mgC•(溞•d)–1】饲养10只对拟同形溞(Daphniasimiloides)得到的体长变化结果[24]是一致的。

4.2.2不同食物浓度对大型溞繁殖的影响幼溞的数量是反映亲溞繁殖能力的主要指标[6–7]。在本研究中,0.01、0.05、0.10、0.15、0.20和0.30mgC•(溞•d)–1食物浓度组所产幼溞数量的平均值和标准差分别为3±3、68±10、118±16、164±15、205±22和231±20,统计学分析结果表明各食物浓度组所产幼溞数量的平均值之间均存在显著性差异(P<0.05),表明食物浓度越高,大型溞生殖幼溞的数量就越多[8,10]。罗晓霞和刘正文的研究表明食物浓度过高或过低均不利于溞类的繁殖[24]。在本研究中,高食物浓度组中并未出现造成大型溞生殖幼溞的数量下降的情况,可能是设置的食物浓度还未足够高;而当食物浓度低至0.01mgC•(溞•d)–1时,大型溞生殖幼溞的数量急剧下降,与Sims[8]的研究结果也相一致。

4.2.3大型溞繁殖试验中食物浓度的选择在本研究中,当食物浓度为0.05mgC•(溞•d)–1时,亲溞生殖幼溞的数量的平均值为68只,就能满足OECD、ISO和国内的大型溞繁殖试验方法[6,22–23]对每只亲溞所产存活幼溞的平均值≥60只的有效性要求,但是食物浓度低于其推荐的0.1—0.2mgC•(溞•d)–1范围。因此,对于能吸附于藻细胞或被藻细胞降解的化学物质[11–16]的大型溞繁殖试验测试,可调整食物浓度在0.05—0.1mgC•(溞•d)–1范围,有利于受试物暴露浓度的维持。此外,在本研究中,0.20—0.30mgC•(溞•d)–1的食物浓度会使试验溶液比较浑浊,但是并未发现对亲溞的繁殖能力造成影响。但是,由于食物浓度达到0.2mgC•(溞•d)–1时,大型溞的体长增长就基本达到最大值,因此在大型溞繁殖试验中也不建议采用高于0.2mgC•(溞•d)–1的食物浓度。

4.3国内本土大型溞品种的遗传学信息采用分离自中国本土的大型溞品种作为试验生物,严格按照OECD的大型溞繁殖试验方法[6]的条件开展试验,是完全能满足试验有效性的要求的。然而,OECD建议对大型溞的遗传学信息进行鉴定[6]。国外已有不少研究鉴定了不同品系的大型溞的遗传学信息存在差异[32],Baird等的研究也表明大型溞的遗传学信息差异会影响大型溞对毒物的敏感性[32]。但是,国内对大型溞遗传学的研究报道较少,因此,鉴定国内大型溞品种的遗传学信息并与国外的相关研究数据相比较,可能可以获得更多有意义的信息。

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作者：陈进林 梅承芳 高亮 梁笑婷 林振姗 曾国驱 许玫英 孙国萍 单位：广东省微生物分析检测中心 生态毒理与环境安全实验室 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 省部共建华南应用微生物国家重点实验室