维生素C对免疫细胞功能的影响范文

《免疫学杂志》2016年第二期

[摘要]

目的通过研究VC处理过的DC细胞在过继免疫T细胞培养中是否发挥促进作用，进一步探讨维生素C对于免疫调控的作用机制，同时为制备非特异性CTL提供方法及思路。方法采集健康志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离外周血PBMC，贴壁后获得单核细胞。用VC对DC进行孵育（24h）后经PBS洗涤，培养5d后与添加anti-CD3+单抗的T细胞混合培养至第12天，同时设立空白对照组（noneDC组、0mmol/LVC-DC组）。流式细胞仪检测T细胞亚群及细胞因子分泌情况。LDH法检测VC对DC-T细胞非特异性杀伤情况。结果VC处理的DC细胞可显著刺激T细胞成熟，其CD8+CD28+及CD40L表型有显著升高（61.23%±6.78%，68.87%±4.37%），同时发现Treg细胞明显降低（4.51%±1.22%）。细胞因子分泌情况分析结果显示，vcDC可促进T细胞因子分泌，IFN-γ、IL-2有显著升高（32.29%±3.26%，19.66%±4.37%），IL-4有显著降低（3.36%±1.29%）。杀伤结果显示对不同肿瘤细胞非特异性杀伤有明显增强。结论VC通过致敏DC进而可激活T细胞向非特异性CTL（CD8+CD28+）分化，提高T细胞因子分泌能力。

[关键词]

维生素C；树突状细胞；T细胞亚群；非特异性T淋巴细胞毒性效应

维生素C是一种有效防止氧化损伤的抗氧化剂，可清除细胞内氧化自由基（O-）[1]。生理范围下，维生素C在血清中的含量一般在70~100μmol/L。研究显示，静脉注射3g维生素C，其受注者血清中VC的含量可达到1700μmol/L，但是如果患者口服相同剂量，血液中VC含量仅达220μmol/L[2]。我课题组前期研究显示，高浓度VC可致敏DC细胞成熟，且当VC为1mmol/L时对DC细胞刺激效果最佳，显著提升DC细胞的成熟度及表面标志物比例。据研究显示VC可作为一种抗肿瘤前体物质调控肿瘤细胞凋亡及抑制生长，大剂量的VC（约5mmol/L）可引起肿瘤细胞的凋亡，当黑色素瘤细胞B16F10暴露在VC中时[3-4]，VC可引起细胞色素C释放进而引起线粒体酶减少。还有研究显示，VC可通过下调CD71（转铁蛋白）的表达进而降低细胞对金属离子（铁离子）的摄入，后者被认为是维持肿瘤细胞活性必要的因素之一[5]；而低剂量的VC（小于1mmol/L），又可通过调节Chk2-p53-p21Waf1/Cip1途径以及影响细胞膜上受体生长因子，如胰岛素样生长因子（IGF）-1等来抑制肿瘤细胞增殖[6]。同时，对于VC的抗肿瘤机制又有了新的发现，VC可以通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）的表达而抑制肿瘤血管生成[6]。而另据Chen等[7]研究认为VC抗肿瘤机制可能是VC会释放游离过氧化氢，直接作用于肿瘤细胞DNA干扰肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡。但VC作为免疫调控物质的研究却鲜有报道。Hwang等[8]研究显示，VC可显著刺激CD4+T细胞分化，并提高Th1型细胞比例，同时释放大量IL-12，而据其另一篇报道显示[1]，VC还可提高CD8+memoryT细胞比例。但VC在过继免疫细胞培养过程中如何发挥作用尚未有所报道，本文就VC致敏处理过的DC细胞与T淋巴细胞混合培养，并对T细胞亚群变化及细胞因子变化等情况进行分析。

1材料与方法

1.1试剂耗材维生素C（VC）（Sigama公司），RhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α（Peprotech公司），10%胎牛血清（杭州四季青），RPMI1640（Scientific公司），FITC标记CD86mAb、PE标记CD80mAb、APC标记MHC-IIDR、FITC标记CD40mAb、PE标记CD40L（CD154）mAb（BD公司）。Ficoll分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.2仪器设备倒置显微镜（奥林巴斯），CO2细胞培养箱（Thermo），台式冷冻离心机（湖南湘智），台式高速离心机（Eppondorf），流式细胞仪（BD公司），生物安全柜（新加坡ESCO）。

1.3细胞分离采集健康志愿者外周血50ml与PBS溶液按照1∶4混合均匀，将稀释后的血液以1∶1比例缓慢加入淋巴细胞分离液上方。于4℃、700g离心15min。小心吸取单个核细胞层，加入另一离心管中，并用4倍体积PBS洗涤250g离心5min，去除淋巴细胞分离液。PBS洗涤2次即获得外周血单核细胞。

1.4DC细胞培养外周血单核细胞悬浮于1640培养基中，调整细胞数为1×108/ml，于48孔细胞培养板上贴壁。在37℃、5%CO2培养箱中培养3~6h贴壁后，收集悬浮细胞，贴壁细胞PBS荡洗2次后为DC前体细胞，于倒置显微镜下观察计数，加入1640培养基：GM-CSF（800U/ml）和IL-4（1000U/ml），调整细胞数约为1×106/ml并继续培养。

1.5T淋巴细胞培养外周血单核细胞分离贴壁后，收集未悬浮细胞于1640培养基中（10%FBS），调整细胞数为1×107/ml，加入到包被有anti-CD3+单克隆抗体的细胞培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养。1.6不同浓度VC对DC的影响于DC孔板细胞培养液中加入不同浓度VC，浓度梯度为0、50、500μmol/L、5mmol/L。DC细胞贴壁洗涤后，加入上述浓度VC（RPMI-1640，10%FBS,GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml）孵育24h后洗涤，之后加入培养液RPMI-1640、10%FBS、GM-CSF800U/ml和IL-41000U/ml培养。于第5天将DC与T细胞混合培养至第14～15天。

1.7T细胞增殖、表型及细胞因子分泌水平检测不同浓度VC处理的DC细胞于第5天与T细胞（1×107）混合，混合比例1∶10，连续培养至第20天，期间在第5、10、15、20天检测T细胞数量并作分析。于第15天检测细胞表型，用Percp-CD3mAb、FITC-CD4mAb、APC-CD8mAb、PE-CD28mAb、APC-CD25mAb/CD127mAb、PE-CD40L（CD-154）mAb标记T细胞30min。之后用流式细胞检测仪进行表型检测。检测CD8+T细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ水平。

1.8LDH法检测vcDC-T对肿瘤细胞株杀伤活性复苏肿瘤细胞株k562、A549、DLD1，调整细胞数，以不同效靶比与T细胞混合，室温下杀伤4h，LDH法检测T细胞对肿瘤细胞株杀伤能力。

1.9统计学分析数据均以均数±标准差表示，应用SPSS21软件，两样本均数的比较采用配对的t检验，多样本均数的比较采用方差分析，方差不齐用秩和检验，检验水准α=0.05。P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1vcDC可促进T细胞增殖我课题组之前研究结果显示，VC可显著提高DC细胞表面共刺激分子及CD40表达，并且随着VC的浓度呈现梯度依赖性和时间依赖性，且浓度为1mmol/L时VC对DC细胞的刺激作用最明显，培养最佳时间为3d。因此本实验VC浓度为1mmol/L（0mmol/LVC组及无DC组为空白对照组），处理DC24h后经PBS洗涤2次，更换至1640培养液中继续培养5d。与T细胞混合连续培养至第20天，T细胞增殖曲线（图1a）结果显示，在CD3+单克隆抗体存在的前提下，T细胞有显著增殖，但由VC-DC引起的T细胞增殖并不明显（P>0.05）无统计学差异；而在CD3+单克隆抗体不存在时，检测到T细胞增殖可受VC影响（图1b）（P<0.05），结果有统计学意义。这提示VC确实可通过激活DC细胞进而刺激T细胞增殖。

2.2vcDC可促进CD8+CD28+T细胞增殖及CD40L表达将DC细胞与T细胞混合培养至第15天，检测T细胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD8+CD28+及CD40L表型。图2结果显示，3组中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+没有显著差异，这很可能因为anti-CD3+单克隆抗体的添加使得CD3+T细胞被显著刺激，且T细胞亚群中主要以CD3+CD8+亚群为主（80.4±%3.32%），但同时结果显示CD40L、CD8+CD28+比例却有显著不同，表现为VC-DC组二者有显著提高。本课题组之前研究已证明，VC除可显著提高DC细胞表型外还可有效刺激CD40表达，而当DC与T细胞混合后CD40可激活T细胞表面CD40L表达（68.87%4.37%）同时活化T细胞CD8+CD28+比例提高（61.23%±6.78%）。

2.3vcDC可显著降低CD4+CD25+CD127lo/-(Treg)细胞比例为考察负性调节T细胞（Treg）亚群表达情况，本文检测了CD4+CD25+CD127lo/-细胞比例，图3结果显示，VC-DC组Treg比例明显降低，说明VC-DC可降低T细胞亚群中负性调节细胞分化。

2.4vcDC与T细胞共培养可显著提高CD3+CD8+细胞因子分泌能力经anti-CD3mAb激活的T细胞，其亚群中主要以CD3+为主，其中CD3+CD8+比例占到80%以上，因此我们考察了VC浓度为0.5mmol/L时DC诱导CD3+CD8+细胞亚群分泌细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表达比例。流式结果显示，VC-DC组T细胞中CD3+CD8+细胞分泌细胞因子能力明显高于未经处理的DC组（图4a、b），表明VC可通过致敏DC进而激活T细胞，刺激非特异性CTL产生。之后我们做了不同浓度VC对DC-T细胞因子诱导情况分析，结果显示，在VC的生理浓度范围内（0.05～2mmol/L），VC可显著刺激DC成熟（此部分研究结果已发表），进而诱导T细胞提高细胞因子分泌能力（图4c），而当VC浓度显著过高时，表现出一定程度的细胞毒性效应（图3c，5mmol/LVC-DC组）。这也提示我们，VC的用量并非越大越好，高浓度大剂量VC的使用可能会对免疫系统造成一定程度的危害。

2.5vcDC可提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性为考察VC-DC组与未处理DC组混合培养的T细胞对不同种类肿瘤细胞株杀伤能力。选择效靶比20∶1，杀伤时间4h。杀伤结果显示（图5），VC-DC组T细胞杀伤活性有所提高，上述结果说明，VC作为一种重要的功能性小分子物质，在免疫调控中发挥重要作用，而对于过继免疫细胞治疗，特别是以DC为诱导的DC-T细胞治疗，VC可通过快速诱导DC成熟，刺激DC表面二类分子活化，促进CD40表达，进而激活T细胞，使得非特异性CTL效应显著提高。

3讨论

维生素是人体必需的一族小分子化合物，在机体的发育、生长、细胞分化等生物学过程中发挥重要作用，其中以维生素C最具代表[9]。维生素C又称抗坏血酸，是一类具有强还原效应的维生素，对机体内保持细胞氧化-还原微环境的平衡、抵抗氧自由基（O-）[10]起到关键作用。研究显示，氧化还原作用（Redox）[10-11]对机体生理学效应非常显著，而在炎症诱导的肿瘤微环境[12]中也起到至关重要的作用，这包括炎症的发生，慢性炎症导致的组织癌变[12]，肿瘤的发生、发展，肿瘤抗原二聚化（多聚化）对肿瘤细胞免疫原性的调节，免疫防御系统的调控等诸多方面[13-14]。

维生素C作为一种机体必须的小分子活性物质，发挥重要作用是人体必须的一种营养物质[9]。研究显示，VC具有一定的抗肿瘤效应，这包括VC直接对肿瘤细胞的抑制、凋亡影响，但前提是在高浓度VC的情况下[2,10]；而另一方面，VC可调控机体免疫系统[15]，近年来以VC为基础的免疫调控机制研究越来越受到研究学者的重视，并且取得了显著成果。VC可促进T细胞成熟，并且促使CD4+T细胞向Th1型增殖、分化的同时，研究学者还发现VC可促进CD3+CD8+T细胞记忆功能的提升[16]，而上述免疫调控反应却是以DC细胞为基础的，即VC通过调控DC功能进而影响T细胞分化（直接用VC影响T细胞没有上述调节功能）。我课题组前期研究结果显示（已接收），VC可显著提升DC细胞表面CD80、CD86、HLA-DR表达，同时我课题组还发现VC可显著刺激DC表面CD40表达，这揭示DC可能通过VC的氧化-还原调控能力影响DC细胞分化、成熟及功能，进而影响T细胞亚群及免疫功能。过继免疫治疗是目前应用程度相当广泛的治疗方式，为了快速扩增CD3+T细胞，在培养过程当中一般添加anti-CD3+单克隆抗体，而培养的细胞主要以CD8+T细胞为主。本研究发现，在anti-CD3+单克隆抗体培养体系中，利用VC预处理DC，之后再与T细胞混合培养，其CD40L、CD8+CD28+T细胞亚群会显著升高，表明VC-DC可显著激活活性T细胞的比例，向非特异性CTL方向分化，并且CD8+T细胞因子IFN-γ、IL-2分泌能力也会有显著升高，同时Th2细胞分泌IL-4能力显著降低，并且呈现出对VC的浓度依赖性。而后续肿瘤细胞株杀伤检测也证实上述结论。

既往研究显示，VC通过调节DC细胞功能，可提升CD4+T细胞分化，而本研究中未有明显体现（图2），这很可能是anti-CD3+单克隆抗体的添加，使得T细胞快速、大量扩增，而其中主要以激活CD8+T细胞增殖为主，因此掩盖的VC-DC对CD4+T细胞的调控能力，但从流式检测细胞因子情况分析来看，除CD8+细胞因子分泌能力显著提高外，IFN-γ+CD8-T、IL-2+CD8-T细胞分泌情况也有明显提高（图4），而IL-4+CD8-T细胞变化不明显，无显著意义（P>0.5），这也证实了VC-DC对CD4+T体现相同的调控作用。因此，VC的利用对于过继免疫细胞治疗具有很好的调节促进作用，可作为细胞培养中添加的一种类激动剂。而VC在免疫功能调控中发挥的作用以及其对免疫信号通路的影响，我们还将做进一步研究。

作者：贾原 李文丽 韩亚萍 李芳 张俊萍 单位：山西大医院肿瘤生物治疗科