米糠发热霉变中毛油色素探究范文

《河南工业大学学报》2016年第6期

摘要：

米糠发热霉变使其毛油色泽加深且严重影响后续的脱色效果。采用柱层析色谱和薄层色谱相结合的方法，并以紫外-可见光谱和傅里叶红外光谱作为表征手段，对米糠发热霉变前后其毛油色素成分的变化进行分析。结果表明，与米糠霉变前所提取的毛油相比，霉变米糠毛油的色泽明显加深（罗维朋25.4mm槽测定黄值（Y）35.0时，红值（R）由5.0升高至12.0，蓝值（B）由0增至9.9）；米糠毛油色素的极性成分由3类增至7类；色素中能产生红外吸收和紫外-可见光吸收的官能团种类和数量均发生变化（乙酰基生成、羰基数量增加、羟基数量减少）；发热霉变米糠毛油中色素在426nm和670nm处的可见光吸收较强，而新鲜米糠毛油中的色素在426nm和670nm处的可见光吸收较弱，利用这种差异可以对米糠毛油中的色素成分（原有色素或再生色素）及脱色难易程度进行评价。

关键词：

米糠；米糠毛油；色素；分离；分析

0引言

米糠含油18%～20%，米糠油的脂肪酸组成合理，且含有丰富的谷维素、植物甾醇、维生素E等营养成分[1]。然而米糠油生产却一直面临着毛油酸值高、色泽深难脱除的难题，米糠毛油酸值高的根本原因是米糠中含有大量高活性脂肪酶，而米糠毛油色泽深且色泽固定的原因可能有诸多方面，如米糠贮存过程中的发热霉变[2]，米糠混合油脱溶时高温对其中磷脂、糖类、蛋白质、金属离子等成分的作用[3-7]。油脂色泽加深过程通常伴随着原有色素的固定以及新生色素的生成，这些色素均会给毛油脱色精炼带来难度。目前对油脂色泽加深过程中色素种类分离分析和组分鉴别及表征的研究很少[8]。鉴于对食品如水果、蔬菜、茶叶中色素的研究[9-13]，本课题采用柱层析色谱法和薄层色谱法对米糠油中的色素组分进行分离，并通过紫外-可见光谱仪（UV-Vis）和傅里叶红外光谱仪（FTIRSpectrometer）对米糠毛油色素进行初步的定性分析，以此研究米糠品质劣变对其毛油色素成分的影响以及脱色难易程度的表征评价。

1材料与方法

1.1材料与试剂

米糠毛油：从米糠油加工厂采集米糠，在实验室控制存储条件使其发热霉变，分别用发热霉变前、后的米糠制取浸出毛油。正己烷、无水乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、冰醋酸、石油醚、无水乙醇、钼磷酸、柱层析硅胶（100～200目）、海砂，均为分析纯。

1.2试验仪器与设备

Nicolet6700型傅里叶红外光谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；MTN-2800W型氮吹浓缩装置：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见光谱仪：北京普析通用仪器有限责任公司；Φ21mm×400mm型柱层析色谱柱、国标A型色谱柱：自制；100mm×200mm型薄层层析硅胶G板：青岛海洋化工厂；WSL-2型比较测色仪：上海精密科学仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1米糠毛油色泽的测定

米糠毛油色泽测定参照GB/T22460—2008。

1.3.2米糠毛油色素的分离与浓缩

米糠毛油中色素分离采用硅胶柱层析（CC）分离和薄层色谱（TLC）监控相结合的方法。柱层析硅胶根据色素物质极性强弱的不同，产生不同吸附力。分子极性较弱的色素，在色谱柱上的保留时间相对较短，首先出柱；而极性较强的色素保留时间长，出柱时间较晚；依此原理，再选择合适的洗脱剂进行洗脱，分离色素。薄层色谱法是利用各组分对吸附剂的不同吸附力，在展开剂（流动相）中展开时，各组分按移动的速度不同将其分离开。因此可以利用薄层色谱来监控洗脱液中甘三酯、甘二酯、单甘酯和游离脂肪酸（FreeFattyAcid,FFA）等物质的情况，使得分离的色素中基本不含以上几种物质，从而得到较好的分离效果。

1.3.2.1硅胶柱层析（CC）分离

色素柱层析硅胶的前处理与硅胶柱的装填参照GB/T5009.202—2003。上柱：取米糠毛油约5g（精确至0.01g）均匀溶解于25mL的正己烷中，将其沿柱壁缓缓移到层析柱上，打开层析柱旋塞使样液与海砂面齐平。洗脱：洗脱剂的选择应保证色谱带能充分分离，并且在收集色谱带的时候洗脱液中已基本不含油脂中的甘三酯、甘二酯、单甘酯及FFA。首先，用正己烷洗脱非极性的甘三酯成分，在甘三酯洗脱完全之后采用正己烷与乙醚的混合洗脱剂，在保证色谱带没有被洗脱出柱之前缓慢增加正己烷与乙醚的比例，并通过薄层色谱监控，以除去样品中的甘二酯、单甘酯和FFA，待上述组分均已洗脱除去之后，开始洗脱收集色谱带。慢慢加大洗脱剂的极性，保证色谱带不重叠的情况下洗脱出柱，选用洗脱剂的顺序为正己烷与乙醚混合洗脱、乙醚洗脱、乙酸乙酯洗脱、丙酮洗脱和甲醇洗脱。由此收集到的色谱带进行浓缩之后即为该米糠毛油中极性不同的色素物质。

1.3.2.2薄层色谱（TLC）监控

为了保证收集到的色素中基本不含甘三酯、甘二酯、单甘酯和FFA，需要对洗脱液进行实时监控。基本方法为：用毛细管点样器把层析柱上洗脱下来的溶液轻轻点在离薄层板下沿3cm处，保证点样直径不大于0.3cm，待溶剂挥发之后放置在已配好的展开剂（V石油醚/V乙醚/V乙酸=70∶30∶2）中充分展开，取出，待展开剂挥发完全后用10%的钼磷酸-乙醇显色剂喷洒均匀，然后放置在酒精灯下均匀灼烧，通过薄层色谱有无黑色斑点观察是否洗脱完全。

1.3.2.3色素洗脱液的浓缩

将洗脱液先在旋转蒸发仪上除去大部分的溶剂，然后再转入浓缩瓶中浓缩，之后放置氮吹即可得到油样中极性不同的色素物质。

1.3.3米糠毛油色素的傅里叶红外光谱扫描

开机预热30min待仪器稳定后，设定红外波谱扫描范围为400～4000cm-1，ZnSe晶体ATR测样附件，扫描次数为32，以空气为背景，依次将各个色谱带浓缩出的色素涂抹在ATR窗口上，随后进行光谱扫描，获取样品的透光率－波数图谱。

1.3.4米糠毛油色素的紫外-可见光区全波段光谱扫描

前处理：将收集到各个色素的洗脱剂先配制成3mg/mL的溶液备用；然后用移液枪移取0.5mL于10mL的容量瓶中并定容，即质量浓度为150μg/mL，备用。扫描参数设置：波长范围，1100～190nm；扫描速度，慢速；采样间隔，1nm；比色皿，石英比色皿（10mm）；测光范围，-0.3～3Abs（超过该范围需稀释）；测光方式，双光束等比例检测；以稀释时的溶剂做参比先进行基线扫描，再将3mg/mL溶液进行可见光区扫描，150μg/mL溶液进行紫外光区扫描。扫描结束后，以Excel形式导出数据。

2结果与讨论

2.1米糠发热霉变对其毛油色泽的影响

对米糠发热霉变前、后提取米糠毛油的色泽进行测定（罗维朋25.4mm槽），结果见表1。由表1可知，米糠经不当条件贮存、发热霉变后毛油色泽明显加深，在保持Y值不变的条件下，米糠霉变前、后所制取毛油的R值由原来的5.0增加到12.0，B值由原来的0增加至9.9，其感官颜色由红棕色加深至黑褐色。

2.2米糠发热霉变对其毛油色素成分的影响（图1）

米糠发热霉变前所提取的毛油样品共收集到3条色谱带，发热霉变后毛油样品共收集7条色谱带，由于色谱柱通过色素组分极性的差异将其分离成不同的色谱带，可知发热霉变后米糠所制取毛油中色素组分种类增加，这些新增色素组分对米糠毛油的色泽和脱色效果造成了不良影响。

2.3米糠毛油中色素成分的红外光谱测定

米糠发热霉变前与霉变后毛油中部分色素的红外光谱测定结果如图2所示。由图2可知，1-1、1-2、1-3、2-1、2-3的主要IR峰位置基本相同。霉变米糠毛油色素的第2-2条色谱带（图中省略）的红外光谱图IR峰位置与其第2-1条色谱带基本相同，其第2-4和2-5条色谱带的红外光谱图IR峰位置（图中省略）与第2-3条色谱带基本相同。因此，新鲜米糠毛油色素的3条色谱带与霉变米糠毛油色素的第2-1、2-2、2-3、2-4和2-5条色谱带所含有的官能团基本相同。主要IR峰：官能团区：2924cm-1、2854cm-1、1743cm-1、1462cm-1、1165cm-1；指纹区：721cm-1。样品在2924cm-1处有强吸收说明含有亚甲基，1743cm-1处有强吸收表明含有羰基，但2880～2650cm-1内没有强吸收峰，说明是非醛类羰基；样品在1165cm-1处有C—O—C伸缩振动强吸收，在721cm-1处有长链亚甲基引起的中等强度吸收峰，结合样品光谱在1743cm-1处出现强吸收，可以初步判定色素组成的另外一种可能是长链饱和酯。色素2-6与其他5个光谱图有较大差异。首先样品在1739cm-1、1373cm-1、1234cm-1和1045cm-1处出现较强吸收。样品在1739cm-1处的强吸收说明含有羰基，由于3300～2500cm-1无强吸收峰，说明含有非醛或者羧酸中的羰基；1373cm-1处的强吸收由O—CO—CH3中C—H键的特征弯曲振动产生；1234cm-1和1045cm-1处的强吸收峰说明含有乙酰基（＝C—O—C中类似醚键）；1739cm-1和1045cm-1说明可能含有酸酐。霉变米糠毛油色素的第2-7条色谱带红外光谱图IR峰位置与第2-6条基本相同。这两条色素带中含有O—CO—CH3基团的可能性较大。其次样品在2924cm-1和2854cm-1处吸收变得很弱，这可能是发热霉变过程中产生大量的羰基或者发生聚合反应导致亚甲基相对含量减少的原因。此外，色素2-3在波数1277cm-1处有明显出峰，这可能是因为P＝O键或者醚类物质的生成；色素1-3在3375cm-1的IR峰是—OH的吸收峰，该吸收峰强度在发热霉变的米糠毛油色素中变弱。发热霉变前后的米糠毛油色素在这两处产生的IR峰的差异以及各个色谱带在相同IR峰位置产生不同强度的吸收，都说明了发热霉变对米糠毛油色素的形成产生了作用，改变了色素在红外区的吸收特性。

2.4米糠毛油中色素成分的紫外-可见光谱测定

2.4.1米糠毛油中色素成分的紫外区光谱测定

米糠毛油中色素样品的紫外区光谱扫描结果见表2。由表2中新增的波长（倾斜波长）可知，霉变米糠毛油色素的第2-3、2-4、2-5、2-7条色谱带均检测出霉变前米糠毛油的色谱带中所没有的吸收波长λ，说明霉变后的米糠毛油色素新生成了具有紫外吸收的官能团或者原有的产生紫外吸收的官能团在数量上增多。因此发热霉变对米糠毛油中色素的形成产生作用，改变了色素在紫外区的吸收特性。

2.4.2米糠毛油中色素成分的可见光光谱测定

米糠毛油中色素样品的可见光光谱扫描，结果见图3和图4。由图3、图4可知，新鲜米糠毛油色素的色谱带在可见光区的吸收较弱，此外各色谱带的颜色也较浅，而霉变米糠毛油色素的各色谱带在426nm和670nm附近有相对较强的吸收，所以霉变米糠毛油色素的各色谱带颜色相对较深。图5中的各个条形柱分别对应各个色谱带的最大吸收波长。系列1波段内色素的吸收光为紫色，色素表现黄绿色；系列2波段内色素吸收光为红色，色素表现为蓝绿色。系列1和系列2对应的吸光度相对较强，色谱带显现的颜色主要为两个系列对应颜色的复合色（绿色），由于每个色谱带在λmax处的吸光度差异，使得霉变2-6的绿色最深，霉变2-3次之，霉变2-2的绿色较浅。霉变米糠毛油中的色素与新鲜米糠毛油中的色素在可见光吸收上表现出较大的差异，两者在外观颜色上明显可见，这与前者在426nm和670nm附近的强可见光吸收有直接关系。因此，发热霉变影响了米糠毛油色素的组成，改变了色素的可见光吸收特性。米糠发热霉变使其毛油色素组分发生了变化，导致变化的原因是多方面的。首先，米糠霉变后因霉菌自身的颜色使米糠和米糠毛油的色素组分发生变化，如灰绿曲霉对稻米的侵染率很高且显示出典型的绿色[14]，这种绿色成分会在米糠浸出取油时进入毛油；其次，在米糠发热霉变过程中其自身原有色素成分可能发生聚合或者氧化分解形成新生色素的官能团[15]，如羰基数量的增多；此外，米糠中的蛋白质和糖类在贮存和加工过程中发生美拉德反应、米糠油中谷维素、磷脂等含有双键和羰基的组分发生氧化变性等也会有新生色素生成。

3结论

米糠发热霉变会造成其色素组分增加及毛油色泽加深，通过对发热霉变前后米糠毛油中色素成分的分离、浓缩并结合红外光谱及紫外-可见光谱的分析可知，发热霉变使得米糠毛油色素中红外吸收和紫外-可见光吸收的官能团种类和数量均发生变化，如乙酰基生成、羰基数量增加和羟基数量减少等。发热霉变米糠所提取毛油中的色素在426nm和670nm附近的吸收与新鲜米糠毛油色素表现出较大差异，这使前者绿色成分明显增多，因此可以尝试利用两种色素在这两个吸收波长或者其他吸收波长下吸光度的差异对米糠和米糠毛油的新鲜程度和脱色难易程度进行评价。

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作者:刘玉兰 许利丽 王动民 温运启 郑来宁 单位:河南工业大学粮油食品学院