金钗石斛悬浮培养细胞生长研究范文

《贵州师范大学学报》2016年第5期

摘要:

研究了培养温度、培养时间、初始pH、摇床转速对金钗石斛液体悬浮培养的影响。结果表明，在培养条件分别为培养温度为25℃、培养天数为30d、初始pH为6、摇床转速为120r/min时，金钗石斛原球茎增殖量最大，石斛碱的积累量也相对最高。

关键词:

金钗石斛;悬浮培养;培养条件;增殖;生物碱

石斛属是兰科植物中较大的属，全世界约有1100种，广泛分布于亚洲、欧洲和大洋洲等地。目前供作药用的石斛属植物约有30多种。石斛的主要化学成分是生物碱、多糖、氨基酸、酚类、萜类、甾体及挥发油等［1］。在我国的传统医学中，石斛为常用贵重药材，药用历史悠久，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效［2，3］，现代药理学研究证明，石斛还具有降血糖［4］、抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管等作用［5，6］，石斛的药理与其所含有的石斛碱密切关联。金钗石斛作为贵州省四大主要中药材之一，其资源的再生产对于我省中药产业的发展至关重要。利用植物细胞培养技术生产药用成分可以在人工条件下进行，通过操作培养条件和培养方式能极大地提高生产率，在较短时间内获得大量的目标产物，既节省耕地，又解决了原料来源;既保护了生物多样性，又可实现我国中药资源的保护和中药产业的可持续发展。本研究以金钗石斛为材料，对其在悬浮培养方面应用生物技术手段生产石斛碱有用次生代谢产物进行探讨，得出适合石斛碱悬浮培养细胞生长和石斛碱积累的较佳摇瓶培养工艺条件，旨在对发酵罐中试放大培养石斛生产石斛碱提供研究基础。

1材料及方法

1．1供试材料

金钗石斛采自贵州省赤水市旺隆镇的野生金钗石斛，种子为野生果实，金钗石斛茎段为经驯化后移栽到贵州师范大学生命科学院温室，以栽培存活2年后的茎段为外植体培养再生植株。

1．2金钗石斛原球茎增殖统计方法

用“称重法”对试验材料进行称量(单位:g)，在称量的同时观察记录石斛原球茎的生长状态。增殖系数能较好地反应原球茎的增殖状况，增殖系数=(培养后重量—接种量)/接种量。

1．3培养条件优化

石斛悬浮培养过程中可以控制反应条件，如基本培养基、激素种类［7，8］和浓度、培养条件等来达到最优悬浮培养条件。本实验通过控制悬浮培养培养天数、摇床转速、摇床的温度、初始pH等条件，以增重量和石斛碱含量为衡量指标筛选最优液体悬浮培养条件。

1．4生物碱的测定

石斛碱标准曲线的制作:以石斛碱浓度为横坐标，620nm处吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品总生物碱含量测定:精密称取上述各石斛样品粉末0.5g，加浓氨水适量，加氯仿10mL，60℃回流提取2h，冷却后补充氯仿至原重，抽滤得到生物碱提取液［9］。按标准曲线的制作方法测定吸光度，计算总生物碱的含量。

2结果与讨论

2．1不同发酵温度、发酵时间对金钗石斛悬浮培养的影响

用“称重法”对试验材料进行称量(单位:g)，在称量的同时观察记录石斛原球茎的生长状态。增殖系数能较好地反应原球茎的增殖状况，增殖系数=(培养后重量—接种量)/接种量。选取相同条件下生长良好的原球茎，以1/2MS为基础培养基，控制悬浮培养温度，分别设定为22℃、25℃、28℃、31℃4个温度梯度，分别于悬浮培养第10d、20d、30d、35d、40d，取样称重，计算增殖系数，并对相应生物碱含量进行测定。结果见表1。从表1可知:温度不同对石斛悬浮培养的影响比较显著，31℃时，石斛的增殖系数最小，在培养超过20d后，增殖系数积累量逐渐下降，而生物碱积累量几乎不变;当温度为25℃时，随着发酵天数的延长，石斛增殖系数增大，到培养30d的时候，增殖系数达到最大，为1．114，但是此温度下生物碱的积累却在发酵35d时达到最大，为81.78mg/L，与此温度下培养30天相比差距不大，从成本考虑，选择培养天数为30d为最优，也基本可以看出，石斛原球茎增殖越多，生物碱也相对越多，基本呈正相关，在后面的培养中主要以石斛原球茎增殖量为衡量指标。

2．2初始pH对石斛悬浮培养石斛生物量积累的影响

选取相同条件下生长良好的原球茎，以1/2MS为基础培养基，选择悬浮培养温度为25℃，培养初始pH分别为5、6、7、8，培养天数为20d，按2.1方法称重，计算增殖量。从表2可以看出，在同为在温度为25℃，培养天数30d的情况下，初始pH对石斛悬浮培养影响很大，过酸或过碱都不利于石斛细胞的生长，在pH为6的情况下，石斛生物量积累最快。

2．3摇床转速对石斛悬浮培养石斛生物量积累的影响

选取相同条件下生长良好的原球茎，以1/2MS为基础培养基，选择悬浮培养温度为25℃，培养初始pH分别为6，培养天数为20d，设定摇床转速为100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min。按2.1方法称重，计算增殖量。从表3可以看出，当转速为120r/min时，石斛生长最好，这与别人做其他植物悬浮培养选定的转速一样，说明植物培养转速不宜过快，过快导致耗氧量增加，营养物质损耗快。

3结论

石斛作为珍贵药材，药用历史悠久，药用成分丰富，能治疗多种疾病，石斛人工栽培技术近年来被广泛用于生产石斛活性物质。但人工栽培石斛因生产周期过长、病害严重等原因而受到限制，因此，近些年来，植物细胞悬浮培养不断被用于药用植物生产，已成为目前最有潜力进行药用植物快速繁殖的途径。其主要是通过外植种子(茎)体诱导原球茎，再进行悬浮培养从而建立快速繁殖体系。由于本研究原有的研究基础上已经确定了金钗石斛悬浮培养的基本培养基、植物生长调节剂、碳源、天然添加物等因素，故本实验主要对金钗石斛悬浮培养条件进行优化，结果表明摇瓶最佳悬浮培养条件是:培养温度为25℃、培养天数为30d、初始pH为6、摇床转速为120r/min。

参考文献:

［1］乙引，陈玲，张习敏，等．金钗石斛研究［M］．北京:电子工业出版社，2009:2-5．

［2］屠国昌．铁皮石斛的化学成分、药理作用和临床应用［J］．海峡药学，2010，22(2):70-71．

［3］徐琼，陈素红，吕圭源．3种不同石斛的化学成分及相关药理学研究进展［J］．亚太传统医药，2010，6(4):115-118．

［4］昊妹，徐建华，陈立钻，等．铁皮石斛降血糖作用及其机制的研究［J］．中国中药杂志，2004，29(2):160-163．

［5］杨虹，王顺春，王峥涛，等．铁皮石斛茎、叶多糖含量及多糖部位柱前衍生化－高效液相色谱指纹图谱比较研究［J］．中国中药杂志，2014，39(5):795-802．

［6］王爽，弓建红，张寒娟，等．石斛多糖抗氧化活性研究［J］．中国实用医药，2009，4(30):15-16．

［7］章金辉，操君喜，朱根发，等．春石斛杂交种多糖及生物碱含量比较研究［J］．热带作物学报，2013，34(4):727-731．

［8］金蓉鸾，孙继军，张远名．快速测定铁皮石斛总生物碱含量方法的优化［J］．西南农业学报，2015，28(2):575-579．

［9］王国梅，韦鹏霄，岑秀芬．不同培养条件对金钗石斛原球茎增殖的影响［J］．广西园艺，2005，16(6):2-4．

作者:牛晓娟 林梦莹 杨德彩 张宇斌 单位:贵州师范大学生命科学学院