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人参多糖对鼻咽癌细胞耐药作用分析

2019/01/08 阅读:

摘要:目的研究人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及机制。方法本研究所选取的亲本细胞为鼻咽癌细胞CNE-2,同时建立耐顺铂人鼻咽癌耐药细胞株系CNE-2;采用ATT检测法对亲本细胞和耐药CNE-2在经过人参多糖作用前后顺铂的抑制浓度,同时计算出耐药指数;利用流式细胞仪对人参多糖对耐药CNE-2的增殖抑制率进行检测;使用RT-PCR法对经过人参多糖作用前后CNE-3中的β-cateninmRNA表达进行检测;使用显微镜对经过人参多糖作用前后的β-catenin蛋白表达进行观察。结果经人参多糖作用后的耐药CNE-2对顺铂的抑制浓度与耐药指数降低更为显著(P<0.05);人参多糖对耐药CNE-2具有明显的增殖抑制作用;经人参多糖作用后的β-cateninmRNA表达量得到明显降低(P<0.05);经人参多糖处理后,蛋白表达区逐渐转移至细胞膜。结论人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药有着显著逆转作用,而因β-catenin信号转导途径诱导CNE-2凋亡是该药物的主要机制。

关键词:人参多糖;耐顺铂;鼻咽癌;细胞耐药;逆转作用

引言

鼻咽癌具有较高的致死率与发病率,该疾病对化学治疗手段与放射治疗手段较为敏感,在近年来,随着耐药细胞株的出现,使鼻咽癌患者在患病后5年内的存活率仅达到60%左右。根据相关调查资料显示[1],人参中所包含的人参多糖成分在进入人体后,能够起到明显的逆转肿瘤耐药以及抗肿瘤的效果,但其中的机制尚不明确。由此,为了进一步观察人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及机制,本研究将鼻咽癌细胞CNE-2作为亲本细胞展开研究分析,并将详细结果报道如下。

1资料与方法

1.1使用材料。人参多糖注射液(产自山西普德药业公司,规格为3g/L)、顺铂(产自上海源叶生物)、人鼻咽癌耐药细胞株系CNE-2(由天津市肿瘤系研究所提供)、二甲基亚砜、二甲基四氮唑蓝、CCK8试剂(来源于国内卡迈舒生物科技)。

1.2实验方法1.2.1将培养箱内温度调整为37℃,且湿度适宜,将耐药细胞株诱放置其中培养。使用顺铂含量为3.3μmol/L的培养基对培养细胞进行1d的培养,并测定培养过程中的IC50。使用顺铂含量为3.3μmol/L的培养基对培养细胞进行冲击培养,时长1d。后更换为顺铂IC50逐渐提高的培养基,直至培养细胞能在顺铂含量为3.3μmol/L的环境中稳定成长,且能够实现长达3次或3次以上的连续传代,经最后测定顺铂IC50为7.5μmol/L,并将其命名为耐药CNE-2。1.2.2使用MTT法测定药物敏感型和人参多糖干预。取对应的耐药CNE-2以及亲本细胞,将细胞密度调整为1×105个/mL,并在其中加入孔板96个,设置处理孔进行细胞培养,培养时长为48h,在每隔处理孔中加入10mg/ml的15μLMTT,持续培养4h后将培养基吸出,并在每个孔中加入200μLDMSO,轻微震荡使结晶溶解。在酶标仪上对各个孔的吸光度数值进行检测,后使用MTT分析法展开数据分析,同时计算出耐药指数与IC50,以此得出最终的药物敏感性。耐药指数=/耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。1.2.3使用CCK8法观察人参多糖对耐药CNE-2的增值影响。使用对应的耐药CNE-2制作密度为5×104个/L细胞血液,并把细胞悬液接种在孔板上,于1d之后,在孔板上加入不同浓度的人参多糖培养液,在设置空白对照的同时,进行比色试验。细胞增殖抑制率=(1-AGPS/A空白对照)×100%。1.2.4观察人参多糖对耐药CNE-2中β-cateninmRNA的表达影响。使用RT-PCR法,并取对数长生期,选择经人参多糖培养液处理48h后的耐药CNE-2,提取其中的RNA,对β-cateninmRNA的表达进行检测观察。1.2.5观察人参多糖对耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达区域的影响。将耐药CNE-2接种与6个孔板之中,并放置在温度为37℃的CO2培养箱中过夜,当细胞株铁壁后,将0.4g/L的人参多糖培养液加入其中,处理时长为48h。使用显微镜对检测结果进行观察[2]。

1.3统计法分析。本研究所获的所有数据均通过统计学软件SPSS20.0统计处理,计数资料用“[n(%)]”表示,用“χ2”检验;计量资料用“(±s)”表示,用“t”检验,若P<0.05,提示差异有统计学意义。

2结果

2.1观察在经过人参多糖作用前后耐药CNE-2的耐药指数与对顺铂的IC50。在经过人参多糖作用前的耐药CNE-2与亲本细胞对顺铂的IC50为(0.16±0.12)μmol/L、(7.51±2.82)μmol/L,耐药CNE-2对顺铂的耐药指数为26.7;在经过浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L的人参多糖作用48h后,耐药CNE-2与亲本细胞对顺铂的IC50为(3.22±1.13)μmol/L、(1.15±0.52)μmol/L、(0.65±0.39)μmol/L,耐药指数为9.6、6.4、3.3。由此可见,相较于作用前,经人参多糖作用后的耐药CNE-2的耐药指数与对顺铂的IC50明显降低(P<0.05)。

2.2观察人参多糖对耐药CNE-2增殖产生的影响。人参多糖对耐药CNE-2增殖有着明显的抑制效果(P<0.05),见表1。

2.3观察在经过人参多糖作用后耐药CNE-2中β-cateninmRNA的表达。在经过不同浓度的人参多糖作用48h之后,耐药CNE-2中的β-cateninmRNA的表达量为2.4观察经人参多糖作用后耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达区域变化。经人参多糖作用前,耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达区域主要在细胞质以及细胞核;经人参多糖作用后,耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达区域逐渐转移至细胞膜。

3讨论

根据相关研究资料显示[3],人参多糖能够有效提高人体免疫力,同时还具有良好的抗肿瘤与治疗肿瘤疾病的效果,且能减少一定的不良反应,具有较高的使用价值。本研究结果显示,经人参多糖作用后的耐药CNE-2对顺铂的抑制浓度与耐药指数降低更为显著(P<0.05);人参多糖对耐药CNE-2具有明显的增殖抑制作用;经人参多糖作用后的β-cateninmRNA表达量得到明显降低(P<0.05);经人参多糖处理后,蛋白表达区逐渐转移至细胞膜。证实了使用人参多糖治疗鼻咽癌,对该疾病患者来说具有重大的现实意义。综上所述,人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药有着显著逆转作用,而因β-catenin信号转导途径诱导CNE-2凋亡是该药物的主要机制。

参考文献

[1]孙冰洁.人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及其机制[J].山东医药,2017,57(20):31-33.

[2]吴晓民,赵丹,朱艳萍,等.人参多糖的药理作用与临床研究进展[J].人参研究,2016,28(05):40-46.

[3]赵燕.人参皂苷Rg3对鼻咽癌Th1/Th2细胞因子表达情况及临床治疗效果分析[J].陕西中医,2018,39(01):101-103.

作者:徐林娣 单位:江阴市中医院

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