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人参皂苷的制备及抗氧化活性研究

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摘要:目的从西洋参总皂苷中制备出6种人参皂苷,并研究其体外抗氧化能力。方法利用皂苷分组、高温碱降解、氧化环合等方法制备分离出六种人参皂苷,通过试剂盒分别以总抗氧化能力,羟自由基清除能力为检测指标,设计浓度梯度,以抗坏血酸(VC)为阳性对照,对6种的人参皂苷的抗氧化能力进行评价。结果制备出的6种皂苷分别为(20S)-原人参二醇、(20S)-原人参三醇、(20S,24R)-奥克梯隆、(20S,24S)-奥克梯隆、(20S,25R)-26-羟基二醇和(20S,25S)-26-羟基二醇,其抗氧化能力有剂量效应,浓度越大,抗氧化能力与羟自由基清除能力越强。六种人参皂苷羟自由基清除能力>抗氧化能力。抗氧化能力的大小依次为(20S)-原人参二醇>(20S)-原人参三醇>(20S,25S)-26-羟基二醇>(20S,24R)-奥克梯隆>(20S,24S)-奥克梯隆>(20S,25R)-26-羟基二醇。结论六种人参皂苷体外均具有一定的抗氧化活性,为人参皂苷发挥药理作用及相关机制研究提供参考和借鉴。

关键词:人参皂苷;羟自由基清除能力;抗氧化能力

引言

人参属于五加科多年生草本植物,具有补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目开心益智之功效[1]。现代医药学研究发现,人参的功效成分主要是人参皂苷和人参多糖。人参皂苷根据皂苷元的不同,主要包括达玛烷型四环三萜(包括原人参二醇型和原人参三醇型皂苷)、奥克梯隆型四环三萜和齐墩果酸型五环三萜[2-4]。随着人参皂苷研究的不断深入,目前人参皂苷的制备方法主要有酸水解法、碱水解法、酶解法、缩合法、氧化环合等。现代研究表明,人参皂苷中的部分单体皂苷如rb1、rb2、rd、rc、re、rg1、rg2、rh1等可不同程度地减少体内自由基含量,可延缓神经细胞衰老并降低老年发生的记忆损伤、以及发挥心脑血管和抗癌方面的药理作用。本文利用碱降解和氧化环合两种方法的结合制备出了六种人参皂苷,(20s)-原人参二醇、(20s)-原人参三醇、(20s,24r)-奥克梯隆、(20s,24s)-奥克梯隆、(20s,25r)-26-羟基二醇和(20s,25s)-26-羟基二醇,并以总抗氧化能力,羟自由基清除能力为检测指标,设计浓度梯度,以抗坏血酸(Vc)为阳性对照,对六种的人参皂苷的抗氧化能力进行评价。

1材料与方法

1.1仪器与试剂电热恒温水浴锅;电子天平(esJ200-4B):沈阳龙腾电子有限公司;紫外可见分光光度计(UV2800):日本岛津;移液枪:大龙兴创实验仪器(北京)有限公司;95%乙醇;西洋参总皂苷;柱层析硅胶(200-300目):青岛海洋化工有限公司;硅胶G板:青岛海洋化工有限公司;1,2丙二醇,氢氧化钠,硫酸,无水乙醇,二氯甲烷,甲醇,乙酸乙酯,石油醚,盐酸,二氧六环,过氧间氯苯甲酸均为分析纯;总抗氧化能力试剂盒(货号:YX-c-a504):上海优选生物科技有限公司;羟自由基清除能力测定试剂盒(货号:YX-c-a505):上海优选生物科技有限公司;双蒸水自制。

1.2样品制备西洋参总皂苷200g以500ml95%乙醇加热溶解,取氢氧化钠20g加入32ml水溶解,待全部溶解后加入2000ml乙醇,混匀(醇钠溶液),将醇钠溶液缓缓加入到总皂苷乙醇溶液中,边加边搅拌,放置过夜。沉淀部分为二醇组粗品,转移至搪瓷盘中水浴加热蒸干,滤液部分为三醇组粗品,以盐酸调pH值6.5-7.0,回收乙醇,蒸干,得三醇组粗品。将二醇组粗品和三醇组粗品分别加入到反应釜中,以1,2丙二醇为溶剂,加入375gnaoH,并使釜内温度保持170℃36h。反应结束后用适量自来水稀释,沉淀析出,放置过夜。抽滤,滤液弃掉,沉淀用水反复冲洗,至pH~7.0,转移至搪瓷盘,85℃干燥,即得的原人参二醇和原人参三醇粗品,分别经柱层析分离,以二氯甲烷:甲醇(25:1)为洗脱剂洗脱,得(20s)-原人参二醇(PPd)、(20s)-原人参三醇(PPt)。将PPd和PPt中分别加入1,4-二氧六环中,经浓硫酸调节pH值为3-5,在搅拌下逐滴加入氧化剂过氧间氯苯甲酸,于75℃~85℃加热回流40分钟,冷却至室温,用0.1M氢氧化钠水溶液调节pH值7.0,过滤并浓缩滤液。再以石油醚:乙酸乙酯(1.5:1)为洗脱剂经柱层析分离、重结晶得纯品。经与文献中氢谱和碳谱比对[4-5],该四种人参皂苷分别为(20s,25r)-26-羟基二醇简称(25r)-HPd、(20s,25s)-26-羟基二醇简称(25s)-HPd、(20s,24r)-奥克梯隆简称(24r)-ocotillol、(20s,24s)-奥克梯隆简称(24s)-ocotillol。6种人参皂苷的制备见图1。

1.3抗氧化试验1.3.1总抗氧化能力检测将PPd、PPt、(24r)-ocotillol、(24s)-ocotillol、(25r)-HPd和(25s)-HPd分别配制成3.0mg/ml母液,配制Vc阳性对照母液3.0mg/ml。再将上述母液分别稀释为1.5mg/ml,0.75mg/ml,0.375mg/ml的样品,运用上海优选生物科技有限公司试剂盒(货号:YX-c-a504)测定,详细步骤按试剂盒说明书进行操作,配置成反应总体积为1.02ml,反应中样品体积为0.03ml的反应液,经过显色和紫外下比色,可测得其体外总抗氧化能力,实验按浓度梯度进行,每个浓度样品做两次平行试验。同时按照同样方法做一组抗坏血酸(Vc)阳性对照,进行总抗氧化对比。实验原理是:在酸性环境下,物质还原fe3+-三吡啶三吖嗪(fe3+-tPtZ)产生蓝色的fe2+-tPtZ的能力反映了其总抗氧化能力,通过比色测定便得知其抗氧化能力高低。定义:样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值(△a)所需的标准液离子浓度表示。标准曲线为y=0.6308x+0.1291,r2=0.9989。按液体体积计算,测定总抗氧化能力单位(U/ml)。计算公式:总抗氧化能力(U/ml)=1÷0.6308×(△a-0.1291)×V反总÷V样=53.9×(△a-0.1291)÷cpr△a=a测定-a空白式中V反总:反应总体积,1.02ml;V样:反应中样品体积,0.03ml;cpr:样本蛋白浓度,mg/ml1.3.2羟自由基清除能力测定将PPd、PPt、(24r)-ocotillol、(24s)-ocotillol、(25r)-HPd和(25s)-HPd分别配制成3.0mg/ml母液,配制Vc阳性对照母液3.0mg/ml。再将上述母液分别稀释为1.5mg/ml,0.75mg/ml,0.375mg/ml的样品,运用上海优选生物科技有限公司试剂盒(货号:YX-c-a505)测定,详细步骤按试剂盒说明书进行操作,配制为反应总体积为1.0ml,反应中样品体积为0.25ml的反应液,浓度梯度平行测两组,紫外下记录各自吸收度。其原理是:H2o2/fe2+通过fenton反应产生羟自由基,将邻二氮菲-fe2+水溶液中fe2+氧化为fe3+,导致536nm吸光度下降,样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度,反映了样品清除羟自由基的能力。定义在37℃下60min反应,按照公式计算羟自由基清除率d%。羟自由基清除率d%=(od测定管-od对照管)÷(od空白管-od对照管)×100%

2结果与分析

2.1样品分离结果经过皂苷分组,高温碱降解,氧化环合分别得到六种人参皂苷元,分别为(20s)-原人参二醇(10g)、(20s)-原人参三醇(5.6g)、(20s,24r)-奥克梯隆(1.1g)、(20s,24s)-奥克梯隆(0.7g)、(20s,25r)-26-羟基二醇(0.8g)、(20s,25s)-26-羟基二醇(0.5g)。

2.2抗氧化试验结果2.2.1总抗氧化能力不同浓度的六种人参皂苷总抗氧化能力由总抗氧化能力检测试剂盒测定,结果见表1和图2。由表1和图1可知,与阳性对照抗坏血酸相比,六种人参皂苷均有不同程度的抗氧化活性,并且在0.075mg/ml~0.3mg/ml浓度范围内有一定的浓度依赖性。同浓度下的六种人参皂苷的体外总抗氧化活性大小依次为PPd>PPt>(25s)-HPd>(24r)-ocotillol>(24s)-ocotillol>(25r)-HPd,PPd总抗氧化能力最高,(25r)-HPd最低。2.2.2羟自由基清除能力不同浓度的六种人参皂苷羟自由基清除能力见表2和图3。与阳性对照抗坏血酸相比,六种人参皂苷均有较强的羟自由基清除能力。在0.075mg/ml~0.3mg/ml的浓度范围内,六种人参皂苷与Vc的羟自由基清除能力均具有浓度依赖性,随着浓度的升高,其能力也逐渐提高。羟自由基清除能力在六种人参皂苷上区别表现明显,大小依次为:PPd>PPt>(25s)-HPd>(24r)-ocotillol>(24s)-ocotillol>(25r)-HPd由总体羟自由基清除率数据可以看出(24s)-ocotillol的羟自由基清除能力随浓度变化影响较大。

3结论与讨论

人参皂苷药理作用包括对神经系统的作用,对心血管系统的作用以及抗肿瘤等方面。卞俊等[7]发现人参皂苷可通过减少淀粉样多肽的形成,来抑制微管相关蛋白磷酸化,从而减少脑内老年斑的形成及神经纤维缠结,提高神经的可塑性,对老年痴呆、阿尔茨海默病的治疗提供了药理基础。李娜等[8]在研究人参皂苷rg1时发现人参皂苷通过抗氧化应激等活动,可以保护脑组织黑质多巴胺能神经元,进而在治疗帕金森病上发挥药理作用。陈兆耀等[9]通过研究人参皂苷阐述了人参皂苷在提高记忆力方面的药理基础。杜依楚[10]在研究人参皂苷rg1时,得出结论人参皂苷通过促进神经递质的释放,使神经元之间的信息传递加快,从而解释了人参皂苷对记忆能力提高的原理。丁艳芬等[11]的实验结果表明人参皂苷可以提高机体抗氧化应激能力。张宏伟等[12]在研究人参皂苷rb3中发表人参皂苷可以增强脑组织的能量代谢和抗氧化作用,可以保护脑组织的结论。另外,西洋参茎叶皂苷具有抗失血性休克及对心脏的保护作用。关利新等[13]在用钙离子荧光指示剂fura-2/aM检测西洋参茎叶皂苷对大鼠心肌细胞ca2+内流的影响的试验中,得出西洋参茎叶皂苷对心肌细胞的电压依赖性钙通道有阻断作用的结论。stavroPM等[14]发现西洋参有中等强度的降血压作用。shaoZH等[15]的研究表明,西洋参果提取物可以清除心肌细胞氧自由基。XieJt等[16]的实验结果表明,人参皂苷re对H2o2和oH-有清除作用,从而起到抗鸡心肌细胞氧化的作用。在抗肿瘤方面,黄海英等[17]对人参皂苷rg1的药理活性研究实验表明,人参皂苷可以通过多种途径破坏线粒体膜,释放与凋亡相关的因子,阻碍细胞周期,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。杨逸等[18]同样发现了人参皂苷通过影响细胞周期来抑制肿瘤细胞增殖。YuntK等[19]对人参皂苷rh2的抗肿瘤活性进行研究,结果表明人参皂苷对肿瘤细胞的生长有抑制作用。WangcZ等[20]证明人参皂苷是抗癌活性成分。程汝滨等[21]在人参皂苷rh2的抗肿瘤转移的功能研究中提出核转录因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶和转化生长因子-β等信号通路均与肿瘤的发生和发展存在一定关系。YoonJH等[22]研究发现,人参皂苷可调控核转录因子-κB、丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶和转化生长因子-β等信号通路,来抑制肿瘤细胞的转移。人参皂苷还可以提高小鼠血清中的抗体igG,激活th1和th2细胞因子的生成释放,调节机体免疫功能,影响肿瘤细胞的转移和生长等[23]。人参皂苷大多具有抗氧化作用,并且已经广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品等领域。在生命过程中生物体不断产生有很强生物活性的氧自由基,过量自由基对会造成细胞损伤,张振明等[24]研究表明抗氧剂可直接清除过剩自由基或者可以提高体内抗氧化系统功能,从而起到抗氧化的作用,保护机体细胞不受皮损。Huangd等[25]提出了体外抗氧化实验方法的基础理论,即依靠氢原子转移和电子转移机理。人参皂苷类的抗氧化作用可能是其延缓衰老,抗动脉粥样硬化,抗缺血再灌注损伤等药理作用的共同机制。本文从西洋参总皂苷中制备出六种人参皂苷,(20s)-原人参二醇、(20s)-原人参三醇、(20s,24r)-奥克梯隆、(20s,24s)-奥克梯隆、(20s,25r)-26-羟基二醇、(20s,25s)-26-羟基二醇,经过体外总抗氧化研究实验表明,六种人参皂苷均具有一定的体外抗氧化活性。由两个实验对比看出,抑制羟自由基能力比总抗氧化能力强。在本研究的浓度范围内,六种人参皂苷的抗氧化能力呈剂量效应。当然,也存在一些不足,如六种人参皂苷制备过程中产率不高,且体外抗氧化活性能力数据并不明显,因而在制备工艺方面还有待进一步研究,另外6种皂苷自由基清除能力较弱,对氧自由基本身影响较少,推断可能是通过提高体内sod、cat等抗氧化酶的活性来增强机体的抗氧化系统功能,因此,还需进行体内抗氧化活性实验研究,进一步为人参皂苷的药理作用和机制探讨提供理论依据和基础。

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作者:张馨妍 洪新悦 高连丛 马莹慧 韩柳 单位:吉林医药学院药学院

人参研究杂志责任编辑:张雨    阅读:人次