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论蒲公英中黄酮类物质的快速检测

2018/08/24 阅读:

摘要:比较不同来源蒲公英提取物对芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素5种黄酮物质的高效液相色谱法检测及蒲公英来源对其黄酮物质含量的影响。采用BREEZE-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相A为0.25%乙酸水溶液;流动相B为90%甲醇水溶液,梯度洗脱,流速0.75mL/min,DAD检测波长283nm;柱温40℃。检测方法显示,5种黄酮物质的检测线性范围为0.02~500mg/L;检出限(S/N=3)在0.002~0.04mg/kg;在加标浓度10.0,20.0和50.0mg/kg时,加标回收率(n=6)在86.25%~107.10%,检测方法灵敏有效。检测结果表明,不同来源蒲公英得到的蒲公英提取物中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素5种蒲公英提取物黄酮物质总含量以江苏徐州产蒲公英提取物最高。

关键词:蒲公英提取物;木犀草素;黄酮物质;高效液相色谱

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)为菊科蒲公英属多年生草本植物的干燥全草,别称浦蒲丁、婆婆英、黄花地丁、奶汁草等,蒲公英始载于《唐本草》,为临床常用中药,有清热解毒,消肿散结,利尿通淋之功效,主产于欧洲、北美等地[1-3]。蒲公英在中国有70种,广泛分布于华北、西北、东北、华东、华中及西南各省份,其中以西南和西北地区相对较多。蒲公英资源丰富,来源广泛,是中国常见的野生蔬菜和中草药,其中用于药用来源的至少有27种,最常见的是蒙古蒲公英、热河蒲公英、碱地蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英等6种。蒲公英味苦,性寒,无毒,入肝径、胃经,具有良好的清热解毒、抑菌抗炎、利胆保肝、降血糖、降血脂等作用;蒲公英化学成分复杂,主要含有黄酮类、多糖类、色素类、有机酸类物质[4-7]。研究发现,蒲公英中的有效成分具有提高机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、延缓衰老等作用,被广泛应用于药理、临床、食品、保健品等领域。蒲公英黄酮类化合物更具有增强心血管功能、增强免疫力、抗肿瘤、延缓衰老、抗氧化、降血脂、降血糖等功效,还能减少病毒性心肌炎心肌细胞凋亡,近几年成为研究热点,很多学者对植物蒲公英中黄酮类化合物的提取进行大量研究[8-11]。蒲公英中的活性黄酮类物质包括芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素等,以不同产地,包括四川、福建、广东、江西等地种蒲公英药材为研究对象,对其中的各成分进行测定,对其功效组分的解析及功能的进一步利用,仍有待研究[3,12]。目前,对于蒲公英提取物中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的测定方法主要有重量法、高效液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、薄层色谱法、化学发光分析法等,分光光度法用于测定单一黄酮物质的量或浓度,估算混合物或提取物中总黄酮物质含量,不能对各种黄酮物质分别定量;薄层色谱法和柱层析法能对黄酮物质进行分离,成本低廉,但分析时间长、只能半定量、重复性差;高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、样品用量少等优点,是目前应用最广也最适用于黄酮物质的分离测定方法[12]。采用高效液相色谱、梯度洗脱及灵敏度更高的DAD检测建立蒲公英提取物中5种黄酮物质的测定方法,并对其精确度、回收率等进行评价;比较不同来源蒲公英提取物对其5种黄酮物质含量的影响,以期为蒲公英提取物利用提供依据。

1材料与方法

1.1仪器与材料美国瓦里安PROSTAR230高效液相色谱仪(配有输液泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气装置及化学工作站);离心机(科大创新股份有限公司);200g摇摆式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司);涡流混合器;电热鼓风干燥箱(上海一恒公司);AL2002电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);0.45μm及0.22μm针头微孔滤膜过滤器;Biocel型密理博超纯水系统(美国密理博公司)。乙酸、甲醇(色谱纯,美国TEDIA公司)。

1.2标准溶液及流动相的制备黄酮物质标准品:芦丁(纯度≥98.0%)、槲皮素(纯度≥98.0%)、木犀草素(纯度≥98.0%)、山奈酚(纯度≥98.0%)、异鼠李素(纯度≥98.0%),均购于Flucker公司。标准品储备液:以密理博超纯水配制0.1mg/mL黄酮物质标准品浓度,并于4℃冰箱储存;分别取以上标样液,用密理博超纯水配制成终质量浓度分别为0.1,0.5,1.0,10.0,100.0,200.0,500.0和1000.0mg/L标准品工作液,于4℃冰箱储存。流动相A相:0.25%乙酸水溶液;流动相B相:90%甲醇水溶液。

1.3色谱分析条件BREEZE-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),采用梯度洗脱,洗脱程序为:0~5.0min,90%~80%A;5.0~35.0min,80%~0%A;35.0~40.0min,0%~90%A。进样量5.0μL;流速0.75mL/min;DAD检测波长283nm;柱温40℃。

1.4蒲公英提取物样品处理蒲公英提取物的配制:分别称取水提法得到的江苏徐州产蒲公英提取物、湖北仙桃蒲公英提取物、河南三门峡产蒲公英提取物、安徽池州产蒲公英提取物各2.0000g,用40mL90%甲醇水溶液,溶解于100mL的棕色容量瓶中,置于摇床上震荡提取40min;静置10min,将有机相层转移并在25℃定容到100mL后,储存于1℃~4℃的冰箱,用前稀释到所需浓度。

1.5供试样品溶液的制备将得到的提取液以滤纸过滤,滤液用90%甲醇水溶液定容于25mL容量瓶,摇匀后0.45μm滤膜过滤,10000r/min离心10min后用高效液相色谱分析,外标法定性定量分析。

2结果与讨论

2.1标准品和供试样品色谱图基于该方法的色谱条件结合DAD检测器对5种黄酮类物质标样进行最大吸收光谱扫描,扫描波长190~400nm。分析不同黄酮类物质的最大吸收光谱,5种黄酮类物质在283nm左右均有较大吸收峰,因此,选取283nm作为黄酮类物质的定量检测波长。按照方法提供的液相色谱分离和分析条件,分别精密吸取标准品溶液和江苏徐州产蒲公英提取物、湖北仙桃蒲公英提取物、河南三门峡产蒲公英提取物、安徽池州产蒲公英提取物供试样品溶液各5.0μL,自动进样器进样,分析结果如图1所示。结果表明,在色谱条件下,色谱峰尖锐,各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.4,理论塔板数均大于3100,满足黄酮类物质定量要求。

2.2检测方法学考察

2.2.1线性范围及检出限精密吸取混合标准品溶液,分别稀释0,5,10,20,50和100倍,吸取6种浓度的标准品各5.0μL进行测定。以各色谱峰峰面积积分值(Y)对其浓度(X)进行线性回归。结果显示5种成分至少在0.02~500mg/L的线性范围内线性关系良好(r>0.9900),检出限(S/N=3)为0.002~0.04mg/kg,回归方程、相关系数。

2.2.2精密度试验精密吸取5.0μL标准品,连续进样6次,分别记录5种组分的峰面积,计算得芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的RSD(n=6),分别为1.14%,3.62%,2.92%,2.41%和2.67%,表明仪器精密度良好。2.2.3稳定性试验取江苏徐州产蒲公英提取物供试样品溶液,在0~24h内每隔2h进样1次,分别记录5种组分的峰面积,计算得芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的RSD(n=6),分别为1.37%,2.80%,3.97%,3.60%和1.44%,表明供试样品溶液中5种组分在24h内稳定。

2.2.4重复性试验精密称取6份江苏徐州产蒲公英提取物样品,制备供试样品溶液,在高效液相色谱下测得芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的RSD(n=6),分别为2.03%,3.24%,2.69%,1.38%和3.26%,表明该方法重现性良好。

2.2.5加标回收率试验取6份江苏徐州产蒲公英提取物(芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素浓度分别是104.60,12.69,9.55,34.85和17.22mg/kg,总计黄酮物质含量为178.91mg/kg),每份2.00g,精密称定,置于50.0mL具塞锥形瓶中,分别精密加入3个不同浓度的芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素标准品(10.0,20.0和50.0mg/kg),制备供试样品溶液,在高效液相色谱条件下进样测定,计算回收率。结果如表2所示,在加标浓度10.0,20.0和50.0mg/kg条件下,芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的平均回收率(n=6)分别为106.39%,100.88%,101.36%,89.45%和87.26%,检测方法灵敏有效。

2.3实际样品检测结果分别取蒲公英提取物样品,制备供试样品溶液,在高效液相色谱下进样测定,计算5种组分的含量,结果见表3。从表3可以看出,不同蒲公英提取物中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素总含量由高到低为:蒲公英(江苏徐州)>蒲公英(湖北仙桃)>蒲公英(河南三门峡)>蒲公英(安徽池州)。

3结论

试验采用高效液相色谱法同时测定蒲公英提取物及不同来源得到的蒲公英提取物中芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素5种黄酮物质含量,初步比较不同提取方法对5种黄酮物质含量的影响。检测方法显示,5种成分至少在0.02~500mg/L的线性范围内线性关系良好(r>0.9900);检出限(S/N=3)为0.002~0.04mg/kg,加标回收率为86.25%~107.10%,检测方法灵敏有效。相对而言,江苏徐州产蒲公英提取物的功效最为明显,这与试验对黄酮物质中含量的测定结果一致。

参考文献:

[1]赵守训,杭秉倩.蒲公英的化学成分和药理作用[J].中国野生植物资源,2001(3):1-3.

[2]黄昌杰,林晓丹,李娟,等.蒲公英化学成分研究进展[J].中国现代中药,2006(5):32-33,35.

[3]李诗语,沈明浩.不同采收期蒲公英中功效成分的含量变化[J].吉林农业大学学报,2013(4):438-441.

作者:王文斌 单位:安徽中烟工业有限责任公司技术中心

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