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犬细小病毒单克隆抗体的制备及应用范文

时间:2022-10-14 09:06:32

犬细小病毒单克隆抗体的制备及应用

《动物医学进展杂志》2016年第9期

摘要:

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸,将F81细胞中分离的CPV免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型,腹水抗体效价为1.8×105,交叉试验表明,3E2可与CPV特异性结合,与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,为诊断和研究CPV奠定了基础。

关键词:

犬细小病毒;病毒分离;单克隆抗体;胶体金免疫层析试纸

犬细小病毒病是由犬细小病毒所引起的传染性疾病,可通过直接或间接接触传播,以剧烈的呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特点,可引起犬急性心肌炎。犬细小病毒传播性强,发病率和病死率较高,且可感染狐、貉、狼等动物,对养犬业和皮毛动物等经济动物养殖业可造成巨大经济损失[1]。1977年,美国科学家最先从患肠炎的犬粪便中分离出CPV。1983年,徐汉坤等首次报道了犬细小病毒病在我国的出现。CPV在分类上属细小病毒科,病毒呈圆形或六边形,无囊膜,直径约25nm。病毒颗粒具有球型的衣壳,衣壳内包含单链线状DNA,在DNA两端各有一个发夹样的回文结构,DNA量占整个病毒粒子重量的25%~34%。CPV基因主要编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和非结构蛋白NS1、NS2。VP1和VP2构成病毒的衣壳,其中VP2是主要结构成分和免疫原性蛋白,能够促使机体产生中和抗体[2]。VP1和VP2蛋白对病毒与宿主细胞之间的识别起重要作用,删除VP1或VP2蛋白的突变体均失去了对宿主细胞的感染能力。近年来,CPV非结构蛋白NS1被认为在病毒的致病性和细胞毒方面起主要作用,并在体外可引起肿瘤细胞凋亡[3-5]。目前国内外对犬细小病毒的诊断主要通过临床症状诊断、血常规检查和试纸快速诊断等,前两者存在着依赖临床经验、特异性低等缺点,难以达到对犬细小病毒病快速诊断的要求;而快速诊断试纸条主要被国外产品所垄断[6]。本研究用F81细胞分离的CPV制备获得了单克隆抗体,并用单克隆抗体,初步制备了CPV的胶体金层析快速检测试纸条。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物、细胞株及毒株

猫肾细胞系细胞(F81),购自中国兽医药品监察所;犬细小病毒病料,河南牧业经济学院动物医院提供;SP2/0多发性骨髓瘤细胞,河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室保存;Balb/c小鼠和日本长耳大白兔,购自河南农业大学实验动物中心;含有CPVVP2基因的重组质粒pGEX-6p-1-VP2,河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室构建并保存;犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)和犬腺状病毒(CAV),河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室鉴定并保存。

1.1.2主要试剂与药品

dNTP、DNA提取试剂盒、琼脂糖、DNAMarkerDL2000和蛋白分子质量标准等,宝生物工程(大连)有限公司产品;DMEM、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、50倍HAT贮存液,GIBCO公司产品;胎牛血清,Hyclone公司产品;HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗体、PEG4000、DMSO、BSA及氯金酸,Sigma公司产品;硝酸纤维素膜(NC膜),Millipore公司产品;样品垫和PVC底板,上海金标生物科技有限公司产品;SBAClonotypingSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒,SouthernBiotechnology公司产品;引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成;CPV多抗IgG由河南牧业经济学院生物工程学院生物技术实验室制备;犬细小病毒阴性血清由河南牧业经济学院动物医院提供;其他常规用试剂为国产或进口分析纯。

1.2方法

1.2.1病毒的鉴定

样品由河南牧业经济学院动物医院提供。采集出现血便、高热等疑似CPV感染的犬粪便,加入适量磷酸盐缓冲液,5000r/min离心10min,收获上清液。按常规DNA提取方法提取DNA,置于-20℃保存备用。参照CPV基因序列(基因登录号:M19296.1),设计引物序列为:上游引物P1:5′-AATCACAGCAAACTCAAG-CAGAC-3′;下游引物P2:5′-TAGCAAATTCAT-CACCTGTTCTTAG-3′。以提取的DNA样品为模板,使用Taq酶扩增,反应条件为:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃60s,共30个循环;最后72℃10min。取PCR反应产物5μL用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果[7]。

1.2.2病毒的分离和抗原的制备

将采集的病料加入含1000单位/mL青霉素和链霉素的DMEM细胞维持液(含20mL/L胎牛血清)制成1∶9的悬液,混匀后5000r/min离心20min,取上清,用0.22μm微孔滤膜过滤,置-20℃保存备用。将单层的F81细胞用胰蛋白酶消化,按1∶2传代,按体积10%的病料上清同步接种F81细胞,置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,设立阴性对照,同时逐日观察细胞病变并进行盲传[8-9]。待细胞病变达到80%以上时,反复冻融3次,10000r/min4℃离心30min,收获上清,加入PEG6000浓缩,经过Sepharose4FF凝胶柱层析,收集洗脱峰即为CPV抗原,紫外分光法检测CPV浓度,保存于-80℃。

1.2.3间接ELISA检测方法的建立

以纯化的VP2蛋白作为包被抗原[10],采用方阵滴定确定阳性血清的最佳浓度和最佳抗原包被浓度,建立了间接ELISA方法。通过酶标仪读取OD值判定结果,以OD待检血清>0.4且P/N≥2.1为阳性判定标准。另外检测30份犬细小病毒阴性血清450nm波长处的OD值,并将平均OD值与3倍的标准差(SD)之和作为阴阳性的临界值,即珚x+3SD为确定的阴阳性界限[11]。

1.2.4小鼠的免疫

将纯化的CPV抗原加等体积弗氏完全佐剂初次免疫6周龄Balb/c小鼠,每隔2周分别再注射2次以加强免疫。细胞融合前3d再加强免疫1次注射抗原。

1.2.5杂交瘤细胞的筛选和McAb腹水制备

按常规方法进行细胞融合,使用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化培养,选择能够稳定分泌、效价较高的单个克隆进行培养。按常规方法制备腹水,并采用辛酸-硫酸铵盐析法和亲和层析法纯化腹水中的McAb[12]。

1.2.6McAb亚型鉴定及染色体计数

①采用SBAClonotypingSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒测定制备的CPVMcAb的Ig亚类。②选择生长良好的杂交瘤细胞,用秋水仙素阻断法进行染色体核型分析,在显微镜下选择染色体分散良好的细胞观察计数。

1.2.7McAb的特异性分析

将犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CPV)、犬冠状病毒(CPV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)作为包被抗原进行间接ELISA,检测该单克隆抗体的特异性。

1.2.8胶体金抗体的制备

将200mL0.1g/L氯金酸溶液,搅拌加热至沸腾,迅速加入2mL10g/L柠檬酸三钠溶液,溶液颜色从浅黄逐渐变黑,然后变红,继续煮沸10min,溶液冷却后微孔滤膜过滤,4℃下保存备用。将制备的胶体金,调整pH至8.0后加纯化后的3E2单抗搅拌,室温静止5min,经低温高速离心法纯化获得胶体金抗体[13]。

1.2.9免疫试纸条的制备和初步鉴定

在玻璃纤维上喷涂胶体金抗体。取蛋白浓度为1.5mg/mL的CPV多抗IgG标记在硝酸纤维素膜上,设为检测线;取蛋白浓度为1.0mg/mL的羊抗鼠IgG抗体喷在离检测线5mm处,即为质控线;将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜与样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水纸组装成试纸条。取PCR和ELISA鉴定的犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV),用制备的胶体金试纸条进行检测,验证其特异性。

2结果

2.1PCR鉴定

通过PCR扩增,得到608bp左右的预期大小目的片段,经测序与预期序列一致,证明样品中含有CPV(图1)。

2.2病毒的分离

从第3代开始一般会出现规律性细胞病变,接种病料上清液后约24h~36h,细胞出现弥散性颗粒,胞浆收缩,细胞变圆;约48h病变细胞开始逐渐拉网、崩解、脱落;约72h~96h,细胞病变达80%以上时,收毒,置-80℃保存备用(图2)。

2.3间接ELISA方法建立

采用方阵滴定确定抗原的最佳包被浓度和阳性血清最佳稀释度,阳性判断标准为OD待检血清>0.4,且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1,当抗原的稀释浓度为1∶160,血清的稀释度为1∶80,阴性与阳性血清的OD450nm值相差最大(P/N=9.253)。建立了筛选犬细小病毒McAb的间接ELISA方法(表1)。

2.4杂交瘤细胞株的筛选

经脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞融合并筛选,获得1株能高效分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。间接ELISA检测,3E2腹水效价为1∶1.8×105。

2.5McAb的Ig亚类鉴定检测

抗体的Ig亚类,结果表明,3E2亚类为IgG1型。

2.6杂交瘤细胞染色体数目

Balb/c小鼠脾细胞的染色体为40条,SP2/0骨髓瘤细胞的染色体为62条。统计结果表明,该细胞株染色体数介于90条~100条,大约为小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞染色体数目之和,说明为两者融合产生(图3)。

2.7McAb的特异性检测

将3E2分别与犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)包被的ELISA板进行交叉反应试验,结果发现,3E2与CPV可发生阳性反应,与CDV、CCV和CAV不发生反应,表明制备的McAb与其他犬常见病毒没有交叉反应,制备的3E2单克隆抗体有良好的特异性(表2)。

2.8胶体金溶液的制备

制成的胶体金溶液日光下肉眼观察透明清亮、颜色为酒红色、无沉淀。经紫外分光光度计检测其最大吸收波长为525nm。

2.9胶体金免疫层析试纸的特异性

特异性试验结果显示犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)和犬腺病毒Ⅱ型(CAV)在胶体金免疫层析试纸检测线上均无条带,为阴性。犬细小病毒(CPV)在检测线上均出现特异性条带,为阳性(图4)。

3讨论

犬细小病毒病传播性强,发病率和病死率较高,且一年四季都有发生,绝大多数年龄、品种的犬类都可被传染,但幼犬和纯种犬更易被感染,病死率也高[14-15]。细小病毒感染犬类后,一旦发病治愈率特别低,没有特效药,早期确定犬细小病毒病并予以抗病毒、消炎、补液和止呕等治疗,可以提高疗效和存活率,因此,对CPV的早期检测就非常关键[16-19]。胶体金免疫层析试纸检测方法只需将待测溶液加入试纸条中,静止后一段时间观察结果,不需要仪器设备来读取结果,不需要操作者有专业技能,能减少很大检测工作量和节省大量检测费用,敏感性高,特异性好[20]。但目前我国市场上部分CPV试纸条主要以国外进口为主,价格较为昂贵,市场较为广阔。我们以分离得到并纯化的CPV为抗原,多次腹腔注射免疫小鼠获得了能够分泌抗CPVMcAb的脾细胞,ELISA试验结果表明该杂交瘤细胞产生的McAb只与CPV发生特异性反应,与CDV、CCV和CAV无明显的交叉反应,表明制备的3E2单克隆抗体有良好的特异性。另外,经间接ELISA检测,3E2腹水效价为1∶1.8×105。本试验确定了标记的最佳条件,设定3E2为金标抗体、取蛋白浓度为1.5mg/mL的CPV多抗IgG标记为检测线,蛋白浓度为1.0mg/mL的兔抗鼠IgG高免血清标记为质控线,初步建立了胶体金免疫层析方法。本试验建立的诊断方法特异性强,与其他3种犬常见病毒抗原无交叉反应,具有较好的重复性,与ELISA方法结果一致,可用于CPV的快速检测。下一步我们将在反应条件、稳定性及工艺上进一步改进,以期进一步提高检测灵敏度。本研究分离并纯化了CPV,经免疫Balb/c小鼠后,通过杂交瘤技术获得了1株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞,经鉴定制备出的McAb效价高、特异性强。并在此基础上研发了胶体金免疫层析检测试纸条,快捷准确,在临床上具有很好的应用前景,有一定的社会和经济价值,并为犬细小病毒的深入研究奠定了基础。

参考文献:

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作者:马辉 权国辉 乔宏兴 郑鸣 赵绪永 王永芬 边传周 单位:河南牧业经济学院生物工程学院 郑州职业技术学院材料工程系

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