老鹰茶挥发油提取工艺及抑菌活性范文

摘要：采用水蒸气蒸馏法对老鹰茶挥发油进行提取，以挥发油得率为指标，运用单因素实验和正交实验法考察了提取时间、料液比和超声时间3个因素对老鹰茶出油率的影响，最佳提取工艺条件为：提取时间5h，料液比1:12，超声时间60min。验证实验表明，优选工艺条件稳定可行，在该条件下提取率为(0.29±0.03)%。运用滤纸片法评价了老鹰茶挥发油的抑菌活性，结果表明老鹰茶对大肠杆菌抑制效果最佳(11.86mm±0.23mm)，其次是金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及四联球菌。

关键词：老鹰茶；毛豹皮樟；挥发油；提取工艺；抑菌活性

毛豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.lanuginosa)为樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea)常绿乔木，其叶片革质，呈倒卵状椭圆形或倒卵状披针形，嫩叶两面被灰黄色长柔毛，主要分布于四川、重庆、贵州和安徽等地[1]，尤以四川及其周边地区资源应用最广。据《本草纲目》记载，毛豹皮樟可用于“止咳、祛痰、平喘、消暑解渴”，其嫩叶通常被当地居民制成具有消暑止泻、消食解胀和保肝降脂等功能的茶饮，称为老鹰茶[2-3]。老鹰茶是我国特有的传统“别样茶”，对其开发不仅可以提高产区农业经济水平，也有利于产区旅游业发展。2009年老鹰茶荣获雅安“产品优秀奖”，2010年入驻上海世博会，2011年作为四川省优秀国际旅游商品与外国旅游团成功合作，2012年作为中国地理标志产品进入第十三届中国西部国际博览会。研究表明，老鹰茶中挥发油含量丰富，主要为萜类活性物质[4]，如大牻牛儿烯B、榄香醇和沉香醇等[5]，具有抗氧化与抗菌[5]及抗突变和抗癌[6]等功效，故可作为抗氧化剂和抗菌剂之天然来源，也有成为新型抗肿瘤和抗癌药物天然来源的潜力。现有研究多采用成本低、污染小的水蒸气蒸馏法实现老鹰茶挥发油的提取，但尚未见对该法提取条件进行优化的报道。本研究以挥发油得率为考察指标，采用L9(34)正交实验优选老鹰茶挥发油提取条件，并对其抗菌活性进行评价，为老鹰茶挥发油在天然抗菌剂和防腐剂等方面的开发利用提供科学依据和实验数据参考，以期进一步提升老鹰茶的综合经济价值。

1材料与方法

1.1材料与试剂老鹰茶：四川省雅安市名山区中里镇茶农提供，原料植物标本经中央民族大学生命与环境科学学院龙春林教授鉴定为毛豹皮樟(LitseacoreanaLevl.var.lanuginosa)的枝叶；实验用水：蒸馏水；乙酸乙酯(分析纯)、硫酸钠、DMSO(二甲基亚砜)：北京化工厂；大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草杆菌(ATCC6633)、四联球菌(ATCC35098)：中央民族大学生命与环境科学学院；琼脂培养基：北京酷来搏科技有限公司；滤纸：杭州特种纸业有限公司。

1.2仪器与设备高速粉碎机：永康市天祺盛世工贸有限公司；电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；98-1-B型电子调温加热套(1000mL)：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ5200E型超声仪：昆山市超声仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发器：上海洪旋实验仪器有限公司；挥发油提取装置(冷凝管、10mL提取器、1000mL圆底烧瓶)：北京玻璃仪器厂；超净工作台：北京碧都空气净化设备公司；LRH-250-S恒温恒湿培养箱：广东泰宏君科学仪器股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1挥发油的提取

以《中华人民共和国药典》2010年版一部附录XD甲法为基础，精密称取粉碎40目的老鹰茶50g，置于1000mL装有适量沸石的圆底烧瓶中，按单因素实验和正交实验设计加入适量蒸馏水，并进行超声预处理。将烧瓶置于电热套中，连接提取器和冷凝管，待加热至沸腾后保持相应时间，关火静置30min后读取刻度，记录挥发油体积，并计算样品得率(mL/g)。将挥发油用乙酸乙酯萃取后旋蒸，并用硫酸钠干燥，备用。得率=挥发油(mL)/老鹰茶(g)

1.3.2单因素实验

经文献调查和预实验发现提取时间、料液比和超声时间对老鹰茶挥发油得率有较大影响，设计单因素实验(表1)考察3个因素对挥发油得率的影响，并以提取时间5h、料液比1:10和超声时间40min作为控制变量的实验条件。

1.3.3正交实验设计

选用L9(34)正交表(表2)，以挥发油收率(mL/g)为评价指标，考察提取时间(A)、料液比(B)和超声时间(C)对实验结果的影响，并得出老鹰茶挥发油的提取工艺。1.3.4抑菌活性采用Verma等(2016)所报道的滤纸片法[7]并做相应调整，对老鹰茶挥发油的抑菌活性进行测试。挑取大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草杆菌(ATCC6633)和四联球菌(ATCC35098)菌落置于不同试管中，加入灭菌生理盐水调整浊度，使其与标准0.5号麦氏比浊管的浊度相同，配制不同受试菌菌悬液。分别取上述4种菌悬液100µL用涂布器均匀涂于琼脂平板上，静置片刻后将含有挥发油溶液(DMSO，200mg/mL)或环丙沙星(阳性对照)的滤纸片(直径6mm)置于涂菌平板上，37℃培养24h后，用游标卡尺测量并计算抑菌圈(mm)大小。抑菌圈(mm)=测量值(mm)—滤纸片直径(mm)

2结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1提取时间对挥发油得率的影响

提取时间在一定范围内对老鹰茶挥发油的提取率有明显影响，且当提取时间为5h时得率最高(0.19%)，而超过这一提取时间后得率不再增加，证明老鹰茶挥发油在5h内可以提取完全。综上可知，将提取时间3、5、7h这3个水平用于正交试验。

2.1.2料液比对挥发油得率的影响

随着蒸馏水的增加，老鹰茶挥发油的提取率也随之提高，而当老鹰茶干粉末与蒸馏水比例为1:10时，其挥发油的提取率达到最高(0.17%)，而随后即使增加用水量提取率也不再增加。因此，选取料液比1:8、1:10和1:12这3个水平进行下一步正交实验。

2.1.3超声时间对挥发油得率的影响

当超声预处理时间在(0～40)min的范围内时，老鹰茶挥发油的得率随着超声预处理时间的延长而增加，且当超声时间为40min时得率最大(0.20%)，超过这一范围后老鹰茶挥发油的得率不再增加，且随之有下降趋势。故选取超声时间20、40、60min作为该因素在正交实验(表3)的3个水平。

2.2正交实验分析

从直观分析结果可知，3个考察因素对实验结果的影响顺序为RA>RC>RB，即提取时间是对老鹰茶出油率影响最大的因素，其次是超声时间和料液比。方差分析结果(表4)表明，提取时间和超声时间可以显著影响(P<0.05)老鹰茶挥发油的提取率，而料液比对实验结果的影响不显著。由于粉碎后的老鹰茶在提取过程中容易糊化，故料液比取1:12，最终结合直观分析及方差分析结果确定最佳工艺水平为A2B3C3，即提取时间为5h、加水量为12倍、超声时间为60min。

2.3验证实验

为排除实验误差，确定优选工艺的稳定性，取样品3份，各50g，按确定的最佳工艺条件进行验证性实验，结果如表5所示，平均得率为2.4抑菌活性老鹰茶挥发油对4种受试菌的生长均有一定抑制作用，其中对革兰氏阴性菌大肠杆菌最为敏感，抑菌圈直径大小达(11.86±0.23)mm，其次是革兰氏阳性菌，包括四联球菌[(7.89±0.20)mm]、枯草杆菌[(7.59±0.43)mm]和金黄色葡萄球菌[(6.68±0.32)mm]。因此，老鹰茶挥发油具有一定的抑菌活性。

3结论

老鹰茶是我国特有的传统药食两用植物，民间应用历史已超百年。研究表明，挥发油是老鹰茶的主要活性成分之一，在食品和医药等方面都有很大应用潜能。本文以绿色、简便、低成本的水蒸气蒸馏法为基础对老鹰茶挥发油的最佳提取工艺进行了研究，并采用滤纸片法对其抑菌活性进行了评价。结果表明，提取时间和超声时间能显著影响老鹰茶挥发油提取率，最佳提取条件为超声60min、料液比1:12、提取5h。3次重复验证实验结果均高于文献报道值，说明该工艺效率高且稳定可靠，可为老鹰茶挥发油的绿色工业化开发利用提供一定参考。抑菌测试结果表明，老鹰茶挥发油对测试中的革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、四联球菌和枯草杆菌)均有一定敏感性，其中对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制效果最佳。说明老鹰茶挥发油具有开发成为无毒无害的天然抗菌剂、保鲜剂和防腐剂的潜能，有望在食品加工和医药等方面发挥更大的价值，为当地可持续性生态经济的发展做出贡献。

参考文献：

[1]　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1986,31:296

作者：秦昭1；冯堃1；王文蜀1,2；冯金朝1 单位：1.中央民族大学生命与环境科学学院化学实验中心，2.北京市食品环境与健康工程技术研究中心