娃娃鱼虹彩病害特征分析范文

作者：高正勇曾令兵肖汉兵张辉孟彦肖艺徐进单位：中国水产科学研究院长江水产研究所农业部长江流域水生动物疫病重点实验室湖北武汉

病毒培养及滴度测定

在多个T－25细胞培养瓶中接种EPC细胞，培养至汇合单层，弃去培养液，用无菌的Hank’s液洗涤细胞1次，取细胞培养的GSIV病毒液，以感染复数(MultiplicityofInfection，MOI)为0.5的量接种病毒液于细胞培养瓶中，所接种的病毒液体积为1mL/瓶，加入适量的助感染剂Polybrene(终浓度10μg/mL)，置于25℃培养箱中吸附1h，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶数次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后吸弃病毒液，每瓶加入5mL细胞维持液(含2%(V/V)血清的MEM培养基)，置于25℃培养箱中培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现70%～80%细胞病变效应(Cytopathiceffect，CPE)时收获细胞培养物，－80℃室温条件下冻融2次，于4℃条件下4000r/min离心20min，收集病毒液上清，进行病毒滴度(TCID50/0.1mL)的测定，然后分装于冻存管中－80℃保存备用。病毒滴度测定在96孔微量培养板中进行，病毒液用不含血清的MEM培养基10倍梯度稀释，分别接种于已长满EPC细胞的96孔微量培养板中，每个稀释度设8个复孔，每孔100μL，对照组设8孔，每孔加入100μL不含血清的MEM培养基模拟感染。吸附完毕后弃去病毒液，微量培养板中所有细胞孔添加100μL细胞维持液(含2%(V/V)血清的MEM培养基)，于25℃的条件下培养，逐日观察记录结果，按Reed－Muench法计算病毒滴度(TCID50/0.1mL)［8］。

病毒理化特性测定

1热处理试验

取1.2中制备的细胞培养病毒液3管，实验组分别置于56℃、65℃水浴中保温处理30min，对照置于20℃保温处理30min，然后分别作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

2酸碱敏感性试验

取1.2中制备的细胞培养病毒液3管，实验组分别用HCl(1mol/L)和NaOH(1mol/L)调整其pH值为3.0和10.0，于20℃处理60min后，调节pH值至7.0。对照用不含血清的MEM培养基作相同的处理，然后分别作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

3有机溶剂敏感性试验

3.1氯仿敏感性试验

取1.2中制备的细胞培养病毒液2管，实验组加入适量氯仿，使其终浓度为4.8%(V/V)，置4℃振荡10min，然后以3000r/min离心20min，小心吸取上层水相。对照用不含血清的MEM培养基作相同的处理，然后分别作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

3.2乙醚敏感性试验

取1.2中制备的细胞培养病毒液2管，实验组加入适量乙醚，使其终浓度为20%(V/V)，振荡10min后置4℃下24h，其间摇动数次，然后以3000r/min离心20min，吸取下层病毒液并反复吹打数次使残留的乙醚挥发，对照用不含血清的MEM培养基作相同的处理，然后分别作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

4胰蛋白酶敏感性试验

取1.2中制备的细胞培养病毒液2管，实验组取病毒悬液1mL加入等量的1%胰蛋白酶(pH值为7.4)摇匀，使胰蛋白酶的终浓度为0.5%(V/V)，置37℃作用60min，随后加入4mL新生牛血清(已灭活)充分混合以终止胰蛋白酶的作用，对照用不含血清的MEM培养基作相同的处理，然后分别作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

5冻融次数对病毒滴度的影响

取1.2中制备的细胞培养病毒液6管，于－80℃室温下分别冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，然后分别在EPC细胞中作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

病毒的生物学特性测定

1不同来源细胞系的感染试验

在T－25细胞培养瓶中分别传代培养EPC、CIK、CCK、RTG－2、CHSE－214、PF－Fin等细胞至汇合单层，以MOI为0.5的量接种1.2中制备的细胞培养病毒液，培养并逐日观察CPE。7d后收获病毒，分别在EPC细胞中作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

2病毒的最适培养温度

取生长至汇合单层的EPC细胞(T－25细胞培养瓶培养)，以MOI为0.5的量接种1.2中制备的细胞培养病毒液，试验分为6组，分别于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃条件下培养，逐日观察CPE。7d后收获病毒，分别在EPC细胞中作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

3病毒的繁殖动态

病毒繁殖动态研究参照文献［10－11］进行。取生长至汇合单层的EPC细胞，以MOI为0.5的量接种1.2中制备的细胞培养病毒液，试验分为8个组，分别于病毒感染细胞后的2、6、12、24、48、72、84、96h从培养箱中取出一组，于－80℃室温下冻融2次，4000r/min离心20min除去细胞碎片，分别在EPC细胞中作TCID50测定，设重复(2次)测定试验。

病毒形态的观察

传代培养EPC细胞至汇合单层，接种1.2中制备的细胞培养病毒，待细胞单层出现50%～60%的CPE时，吸出维持液，加入2%(V/V)戊二醛固定液于室温预固定10min，吸出固定液，再添加4mL固定液于冰上固定10min，然后用细胞刮子将细胞刮下，收集于15mL离心管中，2500r/min离心20min取细胞沉淀。细胞沉淀经漂洗、固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色后，在透射电镜下进行病毒的形态观察。

统计分析

实验数据用SPSS13.0进行统计分析，数据均用平均值±标准差(mean±SD)表示，各组数据的差异显著性采用t检验或单因素方差分析(One－WayANOVA)Duncan氏多重比较，显著性水平为0.05，极显著性水平为0.01。

结果

1病毒培养情况及滴度

GSIV能在EPC细胞中稳定增殖，滴度TCID50/0.1mL=109.52±0.69。GSIV接种EPC细胞36h，细胞收缩成团、折光度增加，出现病灶，细胞培养液上清中出现死细胞;接种细胞48h，细胞单层出现脱落，呈破鱼网状，呈现出典型CPE(图1B)。

2病毒的理化特性

GSIV经56℃、65℃两种温度条件下处理30min均能使病毒失去感染活性。pH3或pH10处理GSIV60min，与对照组相比病毒滴度分别下降了8.58、9.04个对数级，差异极显著(P＜0.01)。

有机溶剂－氯仿处理后能使病毒完全失去感染活性，与对照组相比病毒滴度下降了9.33个对数级，差异极显著(P＜0.01);有机溶剂－乙醚处理，与对照组相比病毒滴度下降了7.83个对数级，差异极显著(P＜0.01)。胰蛋白酶处理组与对照组相比病毒滴度下降了6.49个对数级，差异极显著(P＜0.01)(表1)。GSIV于－80℃和室温条件下冻融1～6次，病毒滴度变化不显著(P＞0.05)(表2)。

3病毒的生物学特性

3.1对不同来源细胞系的感染作用

GSIV能在EPC、CCK、RTG－2、CHSE－214、CIK等细胞中增殖。但在EPC、CCK细胞中增殖速度较快，2～3d出现典型的CPE，病毒滴度也相对较高。而在RTG－2、CHSE－214、CIK、PF－Fin细胞中增殖速度比较慢，病毒滴度也相对较低(表3)。

3.2GSIV最适培养温度

GSIV在15～30℃培养条件下均能在EPC细胞中大量增殖并产生CPE，15℃、20℃、25℃、30℃各组之间病毒滴度差异不显著(P＞0.05)，但以25℃培养条件下EPC细胞出现CPE的时间最短;10℃、35℃培养组均未出现CPE，病毒滴度与25℃培养条件下相比较差异极显著(P＜0.01)(表3)。

3.3病毒的增殖动态

病毒在EPC细胞中的增殖动态表明:GSIV接种EPC细胞6h后，病毒滴度开始上升，随后病毒的增殖进入对数生长期，72h时病毒滴度达到最大，以后趋于稳定(图2)。

病毒的形态

感染GSIV的EPC细胞，经超薄切片，透射电镜下观察，发现大量虹彩病毒样颗粒在细胞质中呈晶格状排列，病毒粒子呈正六边形，直径约140nm。

讨论

虹彩病毒(Iridoviruses)是一类胞浆型DNA病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)分为五个属:绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、虹彩病毒属(Iridovir-us)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)和蛙病毒属(Ranavir-us)。其中绿虹彩病毒属、虹彩病毒属感染无脊椎动物;蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、肿大细胞病毒属感染变温脊椎动物。尤其是蛙病毒属的一些成员是导致变温动物发病的一个重要原因，被认为是全球范围内两栖类、爬行类数量减少的主要原因。本实验研究的GSIV对热、酸、碱、有机溶剂、胰蛋白酶处理敏感，这与江育林等分离到大鲵虹彩病毒及王晓红等从虎纹蛙(Hoplobatra-chustigerinus)蝌蚪中分离到虹彩病毒的研究结果一致，说明这些理化因子不仅仅破坏了病毒的囊膜，还破坏了病毒粒子的完整性，使其感染能力大大下降。病毒的冻融处理主要破坏病毒的囊膜，本文中GSIV能够耐受反复的冻融处理，其病毒滴度下降不明显，表明无囊膜的GSIV病毒粒子仍具有感染性，进一步证实无囊膜病毒粒子仍可通过与细胞膜融合的方式向细胞内注入DNA，进而启动病毒的复制。

GSIV在EPC、CCK细胞中增殖速度较快，滴度相对较高;在CIK中增殖速度较慢，滴度相对较低。这与王晓红等研究结果相似，而与江育林等［3］的研究结果有差异，江育林等研究的结果表明，ADIV在BF－2、CO、CHSE－214等细胞中增殖速度较快，滴度相对较高，而在EPC细胞中5d才出现CPE，滴度也相对较低。造成这一差异的原因可能是使用的不同病毒分离株所致，需开展进一步的比较研究。

GSIV在EPC细胞中最适增殖温度25℃，病毒滴度TCID50/0.1mL=109.52±0.69，这与Ariela等的研究结果基本一致，而与王晓红等的研究结果有差异。GSIV在EPC细胞中的增殖动态结果表明，病毒接种细胞6h后进入对数生长期，72h时病毒滴度达到最大并趋于稳定，这提示我们收获病毒的最佳时间。虹彩病毒核衣壳呈二十面体状，中心为电子致密的中央核心体，周围为一个六边形的外壳，在中央核心体和衣壳之间为一层非电子致密区。GSIV感染EPC细胞超薄切片电镜观察，病毒粒子呈正六边形，直径约140nm，呈典型的虹彩病毒样特征。