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棉花后代群体筛选方式分析范文

时间:2022-06-27 11:05:17

棉花后代群体筛选方式分析

转基因植株的筛选鉴定是植物转基因研究的重要环节。目前,转基因棉花筛选鉴定的常用方法为卡那霉素筛选法和PCR分子检测法[1-2]。针对不同试验目的,这两种方法相关报道的文献较多,但都有较强的针对性,在实际转基因棉花育种过程中,这两种方法的应用均存在弊端。卡那霉素筛选法不能反映目的基因的表达效果,其筛选结果缺乏可靠性。PCR分子检测法对试验室要求严格,检测费用昂贵,检测周期长。此外,转基因克隆研究的发展迅速,不断出现新的抗虫基因、抗旱基因、抗病基因[3],通过外源目的基因表达,而进行生物测定的筛选方法各不相同,过程复杂,筛选缓慢。特别是近年,随着大规模转基因研究的相继开展,传统的筛选方法已无法满足大规模转基因后代的高效筛选,尤其是在转基因杂交育种中,需要在开花前得到准确筛选结果,以便育种操作,传统的筛选方法在效率上尚略显不足。因此,探索一种快速,准确、较为系统的筛选方法,进行大规模转基因棉花后代群体的筛选显得尤为重要。本试验结合我国棉花转基因育种中的两个主流方法[4-5],以花粉管导入[6]外源基因自交系T1-T3、转基因杂交育种F1种子为材料,探讨田间卡那霉素筛选与PCR分子鉴定相结合,应对大规模转基因棉花后代筛选的可靠性和实用性,为转基因棉花后代的筛选鉴定提供参考。

1材料与方法

1.1材料供试品种为绿色棉陇绿棉3号、白色棉陇棉2号、棕色棉BC05,均由甘肃省农科院作物所棉花研究室选育、提供,具有纤维品质优良、产量稳定等突出性状[7-8]。转基因鉴定的供试材料为:①通过花粉管通道法对陇绿棉3号、BC05导入抗虫基因GNA、抗旱基因GhABF2的T1-T3;②WBK09、20090713-1979分别与陇绿棉3号、BC05、陇棉2号杂交F1(GNA、GhABF2的基因质粒、引物序列由中国农科院生物技术研究所提供;WBK09含Bt抗虫基因,材料和引物序列均由中国农科院生物技术研究所提供;20090713-1979含BADH抗旱基因,材料和引物序列由新疆农业大学农学院提供),花粉管导入T1-T3材料为海南、敦煌两地繁育所得,WBK09、20090713-1979与供试品种杂交F1由海南育种所得。GNA、GhABF2的基因质粒与WBK09、20090713-1979均携带NPTⅡ标记基因(新霉素磷酸转移酶基因),该基因是目前基因工程中被广泛使用的选择标记,它对植物细胞表现毒性的机理是:卡那霉素干扰了细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成,最终导致植物细胞死亡,而转基因植株抑制了这个过程[9-10]。供试材料种植于甘肃省敦煌市肃州镇隔离试验区。分子鉴定地点为甘肃省农科院生物技术研究所基因工程研究室。

1.2方法

1.2.1卡那霉素浓度梯度试验。设置卡那霉素3.0g•L-1、5.0g•L-1、7.0g•L-1三个处理浓度,在棉花现蕾期,对供试品种顶端倒数第2片真叶用毛笔涂抹药液,各处理50株,以WBK09做对照(经过PCR分子检测,携带NPTⅡ标记基因),3~5d观察统计结果。

1.2.2卡那霉素抗性植株筛选。在卡那霉素浓度梯度试验的基础上,对转基因供试材料进行卡那霉素筛选,对筛选后的阳性植株做标记,以备PCR分子检测。

1.2.3PCR分子检测。剪取阳性植株顶端较嫩叶片,采用改良的CTAB大量提取法[11]提取纯化基因组DNA,针对阳性植株所含不同基因,利用设计好的引物(表1)进行PCR检测。PCR体系所用药剂为Fermentas公司生产,采用引物由Invitrogen公司合成,统计检测结果。

2结果与分析

2.1不同品种敏感性及卡那霉素筛选条件的确定根据田间观察结果,对棉叶与卡那霉素处理反应的表现分为三个等级,Ⅰ级:涂抹叶片正常;Ⅱ级:涂抹叶片有轻微变黄;Ⅲ级:涂抹叶片具有黄色斑点(图1),为了得到可靠的卡那霉素筛选结果,消除棉花叶片自身对卡那霉素具有抗性的试验影响,以Ⅲ级处理结果作为卡那霉素筛选标准。在该筛选标准下,对试验结果进行统计,结果表明:三种浓度的卡那霉素棉叶涂抹,3~5d内,均使陇棉2号、陇绿棉3号、BC05的棉叶百分之百转变为具有黄色斑点的叶片;对照WBK09经过浓度为7.0g•L-1卡那霉素棉叶涂抹,在3~5d内,叶片仍未变化。该结果表明,3.0~7.0g•L-1卡那霉素叶片涂抹,可以明显区分转基因与非转基因植株。此外,参试品种在5.0g•L-1卡那霉素叶片涂抹处理下,百分之百转变为具有黄色斑点叶片,陇棉2号需要3d,BC05需要4d,而陇绿棉3号需要5d;因此,可以认为,陇棉2号棉叶对卡那霉素最为敏感,BC05次之,陇绿棉3号棉叶与卡那霉素反应最为迟缓。在保证准确性的前提下,为了快速得到筛选结果,可以确定陇棉2号的最佳筛选条件为5.0g•L-1卡那霉素叶片涂抹,0~3d观察期;BC05的最佳筛选条件为5.0g•L-1卡那霉素叶片涂抹,0~4d观察期;陇绿棉3号的最佳筛选条件为3.0g•L-1卡那霉素叶片涂抹,0~5d观察期(见表2)。

2.2卡那霉素筛选结果分析在确定卡那霉素筛选最佳条件后,以各品种最佳筛选条件对相关转基因后代进行田间筛选操作,0~5d内,共计筛选出820份叶片未变色的植株,其中,陇棉2号181株,陇绿棉3号324株,BC05315株。陇棉2号、陇绿棉3号、BC05在筛选过程中得到稳定筛选结果的时间分别为第3d,第4d,第5d(表3),该结果表明,针对不同品种确定的最佳筛选条件具有一定的可靠性。由于操作简单,本次试验仅用5d完成21112份转基因棉花后代材料的田间筛选,因此,可以认为,田间卡那霉素筛选可以快速、准确地筛选出具有卡那霉素抗性的转基因植株。

2.3PCR分子检测结果分析对820份阳性植株,进一步进行PCR分子检测,得到具备NPTⅡ标记基因的材料806份,携带目的基因的材料有161份,其中转基因杂交育种F1中,有158份含有目的基因;通过花粉管导入基因的T1-T3材料中,虽然有269份材料验证出NPTⅡ标记基因,但只有3份材料具备目的基因(表4,图2);经过多次重复,结果一致。该结果表明:卡那霉素阳性植株筛选的准确率为98.3%,卡那霉素筛选携带目的基因的转基因植株准确率为20%;处于连锁状态的标记基因与目的基因,在转基因育种过程中没有完全转化或遗传。

3结论与讨论

本试验通过对陇棉2号、陇绿棉3号、BC05非转基因植株进行卡那霉素敏感试验,以确定田间卡那霉素筛选的最佳条件,在此试验基础上,对其相关转基因后代进行田间卡那霉素初筛,对筛选后的材料进行分子鉴定。试验结果表明,在实际转基因棉花育种中,应对大规模转基因棉花后代筛选鉴定,卡那霉素叶片涂抹与目的基因PCR检测相结合,具有简单、快速、准确的特点,是一种高效的筛选方法,具备一定的实用性。在卡那霉素浓度梯度试验中,不同品种的棉叶对卡那霉素的敏感性不同,与白色棉陇棉2号相比,绿色棉陇绿棉3号,棕色棉BC05的叶片小,蜡质层较厚,该生理性状影响叶片与卡那霉素反应。王彦霞、燕丽萍、李举等[12-14]在卡那霉素筛选研究中,使用的卡那霉素筛选浓度也各不相同。因此,不同品种在不同地区做转基因材料田间筛选,要得到准确的筛选结果,必须进行前期梯度试验。在PCR分子检测试验中,标记基因鉴定结果与目的基因鉴定结果相差甚远,这种情况在通过花粉管导入后代的材料中尤其明显,祝建波[15]在研究过程中也发现类似情况,并推测原因是:在转基因过程中,标记基因与目的基因在核酸酶的影响下,形成不完整片段。由于这种原因一般只导致出现个别异常,在本次试验中,试验群体庞大,不会造成差异如此悬殊的标记基因与目的基因鉴定结果,所以,在本次试验的基础上,推测原因为:处于连锁状态的标记基因和目的基因在转基因过程中存在分离情况。该推测需要进一步试验研究进行论证,但试验结果可以明确,卡那霉素筛选准确率低,目的基因PCR鉴定才是准确的筛选方法。在大规模转基因棉花育种中,快速、准确的筛选尤为重要。尤其在转基因杂交育种过程中,需要在开花前得到准确的筛选结果,以便进行亲本选配及杂交组合的田间操作,此时,如果对转基因育种T0进行卡那霉素快速筛选,缩小范围后,再进行准确的分子鉴定跟踪,可以大规模减少后代群体,提高筛选效率,尽早筛选得到含有目的基因的转基因材料,加快其后代进行遗传稳定性、基因表达量的研究,缩短安全性申报及产业化进程。

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