时间：2022-06-27 10:05:48
随着棉花育种进程加快，亲本遗传基础愈加狭窄，一些棉花新品种形态越来越相似，传统鉴别越来越困难。目前有的参试品种存在类同性，甚至用已有品种作为新品种或以杂种F1充当常规品种参加区域试验。随着分子标记技术的日益成熟，在传统的形态鉴别的基础上，结合分子标记技术进行品种身份的识别，淘汰形态相似且DNA指纹图谱相同的品种和与已推广品种相似度高的品种，减少试验与审定的重复性，能进一步提高国家棉花区试的公正性和权威性。构建品种的指纹图谱、鉴别品种的真伪和纯度，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义［1］。SSR（Simplesequencerepeats）分子标记具有重复性好，操作简单，呈共显性等优点。本文应用SSR标记拟先构建棉花区域试验对照种的指纹图谱，为以后参试品种和目前生产上主推品种的指纹图谱构建打好基础。
1材料与方法
1．1材料
供试材料：2011年黄河流域棉花区域试验对照种中植棉2号、鲁棉研28和瑞杂816，其中中植棉2号和鲁棉研28为常规品种，瑞杂816为杂交种。2011年4月27日种植于中国农业科学院棉花研究所东场试验地。
1．2方法
1．2．1DNA提取。6月28日每个品种在田间依次选24株，每株取真叶1片，用CTAB一次抽提法［2］提取叶片总DNA。
1．2．2SSR－PCR扩增［1］。10μL反应体系：1μLDNA模板，1μL10×Buffer（含MgCl2），0．3μLdNTP（10mmol•L－1），0．2μLTaq酶（2．5U•μL－1），0．5μL正引物（10μmol•L－1），0．5μL反引物（10μmol•L－1），6．5μLddH2O。反应程序：95℃预变性1min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸2min，4℃保存。
1．2．38％（质量浓度）聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性胶）［1］。将组装好的玻璃板装在电泳槽上，将配好的8％（质量浓度）聚丙烯酰胺凝胶倒入玻璃板内，待胶完全凝固后加入1×TBE电泳液到电泳槽内，每个孔点样品2μL，200V电压下电泳50min，固定8min，渗透12min，显色后终止反应，照相并记录结果。
1．2．4SSR标记纯度检测。利用22对核心引物进行SSR纯度检测，这些引物已应用于2007—2011年国家和省级棉花区域试验的696个品种（系），多态性好，图谱清晰稳定，重复性好。每株有2对以上引物的谱带与其它植株不一致，判定为杂株，其余植株为正常株。正常株占24株的比例为SSR标记检测的品种种子纯度。
1．2．5SSR指纹图谱的构建。经过室内纯度鉴定和田间比对，每个品种取有代表性的植株2棵，用24对核心引物构建指纹图谱。并以数字编码表示相应引物谱带类型记录于表格内，相当于身份证号码，对每个品种具有唯一性。
2结果与分析
2．1SSR标记纯度的检测结果表1表明，每个品种用22对核心引物做SSR标记纯度分析，中植棉2号有2株杂株，鲁棉研28无杂株，瑞杂816有3株杂株。表明鲁棉研28和中植棉2号纯度好，瑞杂816纯度较好。从图1看出，中植棉2号第1株和第23株为杂株。第1株为常规品种，田间表现为铃比其它植株小；第23株为杂交种，长势明显较壮。鲁棉研28在22对引物扩增的图谱中没有杂株，田间表现也整齐一致。从图2看出，瑞杂816第1株、第10株和第13株为杂株。第1株和第10株图谱一致为常规品种，可能是制种时遗漏未杂交授粉成功的母本花种子，茎秆茸毛较多；第13株为杂交种，明显比正常株晚熟。通过田间比对，对DNA检测为杂株的植株进行多次观察，田间性状表现与SSR标记纯度检测结果有较高的吻合度。一般情况下，常规品种SSR标记纯度高于杂交棉，常规棉在多代自交下基因易纯化；而杂交种制种时只要有一个亲本纯度较差，就会导致F1纯度下降；要求2个亲本纯度均高，F1的纯度才能保证。
2．2对照种SSR指纹图谱的构建对SSR标记纯度检测后的3个品种进行田间比对，剔除杂株，选择生长正常有代表性的典型植株2株，用前述提取的DNA运用24对核心引物制作指纹图谱，图3、图4和图5分别为中植棉2号、鲁棉研28和瑞杂816在相同的24对引物下的指纹图谱。
2．3身份编码的确定24对核心引物在696个陆地棉品种中验证，每对引物在不同的陆地棉品种间的谱带类型基本固定，有的分为3种类型，有的分为6种类型，个别多态性好的引物能分成8种类型。分别把相应的图谱类型转换成编码，用编码来区分品种的差异，与传统的有带读“1”、无带读“0”不同，读法简便，快速。表2表示3个对照种应用的24对SSR引物中，中植棉2号与鲁棉研28有7对引物扩增的谱带不同，与瑞杂816有15对引物扩增的谱带不同；鲁棉研28与瑞杂816有17对引物扩增的谱带不同。常规品种谱带不同的引物数量越多，表明两品种的相似性越小，亲缘关系越远。杂交种的谱带中呈共显性的引物数量越多，表明2个亲本亲缘关系越远，杂种优势可能会更大。
3小结
随着分子技术的不断发展与完善，及国家不断加强对种子的管理，品种的分子图谱的构建和DNA水平上的纯度检测势在必行。棉花与水稻、小麦等自花授粉作物不同，为常异花授粉作物，其天然杂交率在5％～20％［3］，品种的保纯相对困难，对SSR标记纯度要求可以适当下调。2010年国家棉花区试中常规品种（系）SSR标记纯度80％以上占74．5％，SSR标记纯度90％以上占67．2％；杂交种（组合）SSR标记纯度80％以上占47．6％，SSR标记纯度90％以上占33．8％。根据多年田间比对经验，常规棉品种SSR标记纯度在90％以上时，田间纯度好；杂交种由于受2个亲本的制约，SSR标记纯度在80％以上视作合格。