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天然产物对农业化学的重要性

2012/10/17 阅读:

作者:华如春

农业化学品行业正被导向去开发和生产更有效而对环境相容的新产品。夭然产物曾在农药的早期开发中起了重要作用。例如鱼藤(derri的即作为新的发毒物,又作为新作用模式的先导物。拟除虫菊酷提供了从天然发毒物开发农药的一个众所周知的例子。环绕天然产物的合成开发,伴随着大大提高光稳定性,导致了增进杀虫效力,表明也许本身的活性提高不一定总被当作最重要的开发途径。

较近的开发可用两个杀菌剂来说明。甲氧基丙烯酸酷类在小于1pp。剂量下作为杀真菌剂显示出广谱的保护作用。工C工公司和BASF公司对这些化合物的开发,是受到两种天然菌素时robilurin。和oudemon跳n。所显示的抗菌活性效果所启发。该两种菌素是由Aok。教授及其同事在70年代后期从担子菌O二deoans么舒玩。、而己a中首先分离出来的。另一个例子是硝毗咯菌素(pyrrOini衍in)衍生物fenPic10nll,’由Oiba公司开发销售,商品名Bere毛。该天然菌素由假单胞杆菌Ps洲do仍onas属的菌种产生,能对土壤中存在的植物病原菌起生物控制作用。

天然产物农业化学品被发现具有杀虫、杀菌、除草或植物生长调节等活性。有趣的是,大部分杀虫活性化合物来源于植物,而有除草和抗微生物活性的化合物则来源于微生物。其他天然产物是因其作用模式而激起研究。除草剂双丙氨麟(bialaph例)抑制谷氨酞胺合成酶,它在活性结构部分ph洲phin时hricin已被单独开发作为一种产品。ooform邪in和deoxy阳formyc扭都有抑制腺昔脱氨酶的作用而显示除草活性,同样激起很大兴趣。它们模拟四面体反应饰漪rahedralreac七ion)中间体或中间体前的过渡状态。

天然产物的有利和不利点

在报道中宣称具有杀虫、除草或杀菌活性的成千上万种天然产物里,很少可用作农药先导物。主要缺点是低效或广谱的毒性和作用模式。

不适当的活性

例如,许多文献报告的植物毒性(药害)是在胚芽鞘切口上、受伤叶片上或离体系统中进行试验的结果。这些试验也许有助于检验特定的化学分子,但作为初筛则是非常误导的,与相应于田间应用的除草剂或植物生长调节剂的整株植物筛选结果很少有一致性。甚;应用了整株植物,它们对实际靶标可能无关。在真正的靶标上用标准化学品进行早期活性对比测试是重要的。不应忘记,农药的活性在不断提高,在所有农药领域现在的施用剂量己降低JL个数量级。毒性夭然产物并不意味着安全。人们必须留神广谱毒性,必须测试天然化合物的毒性。真菌毒素提供了明显的例子,但还有很多其他例子。这些化合物由于对动物中环境健康的危险性是不适宜开发的。

筛选过程

有许多可供选择的筛选天然产物的方法,本文将概述筛选微生物产生的生物活性代谢物质所包括的关键问题。这个过程是多学科的,需要分析和合成化学家、生物学家和微生物学家,并且在一个活性成份被鉴定和评价之前由许多步骤组成。

筛选投入数

第一个主要问题是质与量之间的平衡。关键问题是产生一个成功的先导物需要筛选多少个生物体?这就必须考虑整个筛选阶梯(ca戍ade)的性质。可以最简单地表明,考虑初筛的性质如何影响合理筛选生物体的数目。例如,如果目标是去发现特定的、不寻常的,作用模式很少已知实例的化合物,这将适宜于在特定的筛子上筛选大量的生物体,最好采用高度自动化的筛选过程。

相反,采用多组成的活体筛选,很可能是每一数额的被筛生物体产生较高的筛得率。这就要仔细选择进入筛选的生物体以避免重复发现并保证菌种变化。这样,对每个生物体的筛选投资相对于大容量筛选要高得多。每种筛选阶梯必须针对特定的目标来设计,并以过程实践所得的知识来指导。待筛选生物体的分离分离生物体可采用几种途径,从广范围的土壤分离程序到非常专一的固定靶标的途径。

人们已找到一些特别有用的途径。利用相关生态小环境作为培养分离生物体的来源常常是有用的。例如,筛选除草剂化合物时,植物病原菌可能是有用的来源。它们产生药害性代谢物参与染病过程,例如由烟草野火病菌产生的毒素恤btoxin。

那些过去不太可能筛选过的稀有菌株的分离,可能获得新的化合物,特别如其产地提示其生长需要不平常的生物化学过程。这种途径,即可从国外、极端环境如温泉或海床收集得到,也可采用新的分离技术从普通土壤中分得。培养这些分离体可能要用特殊方法来处理,如果要使它们达到合适的生理状态产生次生代谢物质,可能需要缓慢生长或有特殊的基质要求。

瞄向特定种群可能是一个有用的方法,放线菌第IV组区是一个例子。Bowen等筛选了该组区的几百个不同种的代表性菌株,记录到比Amyeolat:种内成员平均活性更高的。

Bowen鉴定了Amycola恤种特有的16SRNA(可溶性核糖核酸)区域,将该区域克隆化,制成相应的2llner探测剂。根据William。等人的数字分类学数据库设计了一种分离介质,然后用该探测剂确认由分离板鉴定出Amycola加菌种群落。其他小组开发了不同的分类学特定的分离技术,例如用特定噬菌体选择感兴趣的或剔除某些不感兴趣的分离体。

第四种途径是选择有很大趋向产生生物活性代谢物质的生物体的分离过程。例如有些研究组试图探测产生已知次生代谢物的作用基因的墓因顺序。在同Phini邵和welliog七on合作研究中已证明带有多种抗菌抗性的链霉菌趋向于产生更多的生物活性代谢物质。

培养

为了产生次生代谢物而培养分离体的过程,与原种的分离同样重要。如果微生物不给以导致产生次生代谢物的条件,则耗费在过程其他各步的努力将无用。在培养阶段的主要考虑是诱导次生代谢物有合理的浓度,并在后续培养中使活性再现。此外,如果需要高的工作量,则使用自动化的和/或一次性器材装置是关键的要素。保证方法中没有组份影响筛选效率也是重要的,例如筛选中介质组份的毒性必须避免。

众所周知,不同的培养条件会导致产生不同的代谢物。一般规律如氨的抑制和磷酸盐的调节已经确定。在广大微生物范围内环境因素如何在分子水平上作用于影响代谢物的产生,有关这方面的知识几乎没有,因此许多方法仍旧以实验的经验为基础。采用琼脂表面培养比液体培养有几点好处,包括代谢物产生的重现性较好,提取过程千净和次生代谢物浓度高。

经过适当周期的培养,表面用甲醇提取,挥发除去甲醇后,萃取物配成适当体积,然后进入筛选。该提取方法对细胞内和细胞外的化合物都适用,也对极性的和非极性化合物都适用。产率平均为每板2毫克。

另一个问题是,培养微生物产生次生代谢物要用多少种介质。人们开始时使用4种介质,包含不同的碳:氮比范围和基质复杂度。观察到不同的菌株采用不同的培养基可以得到最大的活性,但事实上只是浓度的差别而不是完全不同代谢物的产生。因此决定每次只用一种培养基,这样可培养4倍的微生物菌株,而当发现任何生物合成偏向时才不时地改变培养基。

筛选

筛选过程的设计取决于最终目标。筛选阶梯可包括许多步骤,包括活体、离体和作用模式检测,还有为了剔除因特殊理由而不希望要的化合物(如毒性)的试验。

筛选阶梯的总的安排将由其包括的步骤数和每一步骤的严密性来决定。只产生少数值得进一步研究的先导物的筛选,要比能产生较多数优良先导物的筛选有较高的投入量。进入筛选阶梯开端的数目将被良好先导物后续研究的努力程度所推动。另一个重要的考虑是筛选阶梯中某一特殊步骤需要的工作量。在某个劳动密集的筛选之前对菌株进行预筛也许是合适的。例如,在土壤试验之前于琼脂上进行简单的种子萌发试验测定一般药害可能是好的筛选,因为土壤试验不仅工作量大而且需要十倍用量的化合物。

在任何天然产物筛选程序中,不可避免地是某些化合物会比其他化合物更频繁地出现。

重要的是应在筛选早期阶段剔除这些较常见的代谢物。在典型的农药筛选程序中最常出现的代谢物是放线菌酮(cycloheximide)和尼日利亚菌素(nigericin),它们都有除草、杀虫和杀菌的广谱活性。人们通过鉴定提取物显示的与纯化合物相似的生物活性谱来对付它们。这些提取物可用薄层色谱或液相色谱等化学分析来测定其是否存在。如果存在,还要看其水平是否可说明观察到全部活性,此时,该菌株可从筛选阶梯中剔除。然而,从谨慎的角度看,剔除一种常见代谢物产生菌而不管其活性水平是冒风险的,这是有理由争议的。人们曾从尼日利亚菌素的产生菌中分离出两种不同的新化合物。

当所有的提取物已经评价,其活性己被确认,那些产生常见代谢物的提取物已被剔除之.后,这时就要选择化学分离的主题来导向活性化合物的分离。在此阶段仍然不可能决定哪些提取物含有最感兴趣的有效的化合物,因为任何一个提取物都可能含有高水平的弱活性化合物和低水平的强活性化合物,或者是多种不感兴趣的化合物的混合物而其总和活性表现是好的。

良好先导物的贮备应超过化学分离的能力。分离新化合物的最好机会是根据生物活性和不平常特性去选择变种。带有某些性质的化合物可能更理想,例如水溶性化合物比脂溶性化合物更可能是内吸性的,而这些可在化学分离过程的早期阶段去选择。

分离/生物检测

传统上化学分离过程从确定活性化合物的极性和pH的影响开始。然后用各种色谱过程进行纯化。选择最适当的系统取决于活性化合物的性质,例如是否用气相或液相色谱,采用正相或反相的填料柱。

在追踪活性化合物时进展速度的一个主要因素是生物检测方法的有效性。理想的生物检测方法是快速和需要化学样品量少。用于指导化学分离的生物检测不必基于为其分离的主要活性只须知道其相关性。例如人们曾用抗真菌的生物检测来分辨杀菌剂,同时也分辨杀虫的和除草的先导物。

特征化

化合物常常在纯化前就可能被鉴别。当这种信息将决定进一步分离的重要性时,当然是人们所希望的。有几种手段有助于化学家早些解析一个结构。产生光谱信息的方法是非常有价值的。例如光电二极管阵列可在线分析从柱流出各组份的紫外光谱。高效液相色谱与质谱联用能提供分子大小及裂片的同样信息。

这些数据以及关于产生微生物和生物活性的鉴别的其他性质,可与Bordy抗生素数据库对照来鉴别任何已知化合物。一般情况下,鉴定一个已知化合物要比解析一个新化合物来得容易。为了确定新化合物结构,X射线晶体衍射图谱常常是必需的,并且要有大量化合物的分离。在此之前对该化合物进行评价以确定其生物学价值也许更有效果。

评价

当纯化合物被分离出来后,天然产物的生物学评价才能真正进行。这将在产生菌株原始的分离和筛选之后数月乃至数年才会发生。即使在某些方面这个阶段是同筛选合成化合物的最初阶段是平行的,但天然产物是完全已知具有良好活性的。除了生物活性价值以外,对天然产物进一步研究时还可考虑下列决定。该化合物可能作为一种有经济潜力的发酵产品,它可能更适合于当作化学合成的先导物,或者它只能提供一种新的作用模式的标准。

结论

天然产物继续为农药产品提供先导物,但首先是作为合成的先导物和作用模式的模型。在这种微生物筛选计划中有许多因素要考虑和平衡。这些因素对每一个计划是不同的,它取决于开发的目标。无数的变异菌种和掌握新的技术是大有可为的。

天然产物对农业化学的重要性

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