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细菌性病害检测的海水养殖研究论文

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1国内外海水养殖品种主要病害检测方法

针对以上养殖鱼种主要细菌性病害,各国研究人员为开发快速、准确、有效的诊断方法广泛开展工作。笔者等将目前已报道的国内、国外主要海水养殖细菌性病害检测方法总结为以下几种类型进行叙述。

1.1基于微生物生理生化检测的方法

针对养殖鱼种细菌性病原的检测,最经典的鉴定方法是对病原进行分离纯化,基于形态学检测、生理学和通过一系列的生理生化实验实现对微生物的初步鉴定。然而,这种方法耗时长、操作繁琐,不利于细菌性病害的快速诊断。法国生物梅里埃公司于1970年开发出一系列微生物鉴定用生理生化检测试剂盒,使细菌鉴定更简单快捷。该系列试剂盒已成为国际公认的鉴定细菌的参考标准,目前在海水养殖鱼类细菌性病害的诊断中,已将API系列试纸条检测结果作为鉴定的辅助手段之一。Abdel-Aziz等采用API20NE生理生化检测试剂盒与分子鉴定相结合,对导致埃及沿海养殖金头鲷和欧洲海鲈大量死亡的病原进行了鉴定,确定了溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种造成病害的主要病原。潘晓艺等根据API20E结果结合16SrDNA和gyrB基因序列比对,确定从发病养殖中华鳖肝脏分离得到的一株致病菌为迟钝爱德华氏菌。除了API系列检测试剂盒,针对一些特殊的细菌性病原还可以采取更为简便的显色培养技术[20]。该技术在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物,使菌落出现不同颜色而达到分离鉴定的目的,如硫柠胆蔗琼脂(thiosulfatecitratebilesaltssucroseagar,TCBSagar)已经被广泛用于霍乱弧菌和副溶血弧菌的分离鉴定。近年来还有很多新型显色培养基被开发出来,如选择性显色弧菌培养基(vibrio-biochromemedium,BCVM),副溶血弧菌在其上生长形成的菌落呈紫色,而其他弧菌则呈蓝绿色,可以更有效的将副溶血弧菌与其他致病性弧菌区分开来。目前这种方法不仅被广泛用于人类病原菌的初步分离鉴定,也越来越多地被应用到水产养殖业病害检测中。

1.2基于分子生物学技术的检测方法

基于分子生物学技术的养殖鱼类细菌性病害的检测方法在已有报道文献中占到50%以上,该方法与传统的生理生化检测方法相比简洁、快速、灵敏度高、特异性强,可用于细菌性病害疾病的预警和诊断。

1.2.1聚合酶链反应技术聚合酶链反应或称多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),是根据生物信息学等方法寻找特定病原菌特异性基因序列设计特异性引物,扩增后产生特异性片段从而达到检测病原菌的目的。目前多数文献针对不同细菌性病害的特异性基因序列设计引物,建立了灵敏有效的检测方法。Pinto等以toxR,tlh,tdh和trh作为目的基因实现了副溶血弧菌的检测;Lee等以创伤弧菌溶血素为靶标,设计特异性引物建立其PCR检测方法。随着PCR技术的成熟,基于多种病菌的同时检测的多重PCR技术逐渐发展起来。Kong等建立了一种以嗜水气单胞菌的气单胞菌溶素基因、弗氏志贺菌ipaH基因、鼠伤寒沙门氏菌ipaB基因、霍乱弧菌epsM基因和副溶血弧菌16S-23SrDNA为目标基因,设计六对扩增后可产生6种不同长度的片段的特异性引物来快速同时检测水产品中这6种致病菌。此检测方法可在12h内完成,检测限可以达到100~102CFU/mL。

1.2.2环介导等温扩增技术(loop-mediatedisother-malamplification,LAMP)由于传统的PCR技术需要精确控制扩增反应各阶段温度,一定程度上限制了其在水产养殖业中的应用。Notomi等于2000年提出的一种只需在恒温条件下就可以进行核酸扩增的LAMP技术。LAMP通过设计两对特别的引物(内引物和外引物)在一种有链置换活性的DNA聚合酶作用下进行的一种自动链置换DNA合成反应。因为DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离成为单链,所以该技术在恒温下就可以进行核酸扩增,已被用于多种水产养殖细菌性病害的检测。Yeh等根据鲶鱼爱德华氏菌eip18基因设计引物进行LAMP扩增,在65℃反应60min后可得到鲶鱼爱德华氏菌基因特异性条带,检测限可达到20CFU/mL,可以从养殖水体样本中实现鲶鱼爱德华氏菌的检出。Surasilp等将LAMP与横向流动试纸条分析相结合,以rpoS基因为靶基因建立了一种LAMP-LFD方法来检测创伤弧菌,对于纯培养检测限可达到1.5×103CFU/mL。

1.2.3实时定量PCR技术(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR)qRT-PCR目前也被广泛用于水产养殖病害的定量检测。该技术特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测同一样本中不同靶序列。Blackstone等以TaqMan探针为基础,采用qRT-PCR技术以副溶血弧菌特异性tdh基因来检测副溶血弧菌,检测限可达到每PCR体系1CFU。Panicker等针对vvh基因设计寡核苷酸引物,建立了以SYBRGreenI染料为基础的qRT-PCR快速、特异性地检测牡蛎组织匀浆和墨西哥湾水体中的创伤弧菌。该方法对于纯基因组DNA的最低检测量为1pg,水体中检测限可达10CFU/mL。许龙岩等根据副溶血弧菌toxR基因和tdh基因设计引物对副溶血弧菌建立了一种基于TaqMan探针的双重荧光PCR检测法。该方法具有良好的特异性,水体中常见非副溶血弧菌细菌均呈阴性,副溶血弧菌的菌浓度与Ct值的反向线性关系良好,检测限为3.6×102CFU/mL。

1.2.4基因探针技术自1975年DNA探针杂交技术被首次提出,基因探针技术已得到了很大的进步和发展。该技术的基本依据是核酸杂交,针对决定病原菌生物体特性的DNA序列设计特异性标记的DNA或RNA探针,就可以通过样品与探针杂交是否形成杂交分子来检测是否存在目标病原菌。基因探针的标记方法主要有放射性标记法和非放射性标记法两种。目前常用的标记物为碱性磷酸酶(AP)和地高辛(DIG)。该技术除用于人类病原诊断,也被用于水产养殖病原检测中。周凤丽等针对溶藻弧菌胶原蛋白酶基因和外膜蛋白基因设计了两对引物对溶藻弧菌进行PCR扩增,对扩增产物以DIG标记制备基因探针用于检测溶藻弧菌,发现胶原蛋白酶基因探针有较高特异性,可用于对溶藻弧菌的检测鉴定分析。Raghunath等用AP来标记基因探针检测海洋食品中的trh+副溶血弧菌,对40株副溶血弧菌、45株其他弧菌和55株非弧菌进行探针杂交,特异性达100%,检测限达到5.0×102~3.4×103CFU/g。

1.3基于免疫学相关技术的检测方法

除分子生物学技术外,免疫学相关技术也被广泛用于水产养殖品种病害诊断。基于免疫学相关的检测方法利用抗原抗体特异性结合的原理,目前应用较多的有酶联免疫吸附法和免疫层析技术。

1.3.1酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmuno-sorbentassay,ELISA)ELISA技术最早出现于1971年,该技术的基础是抗原抗体特异性反应,常用的ELISA方法有竞争法测抗原、间接法测抗体和双抗体夹心法,其特异性取决于抗体的特异性。Smith等最早将ELI-SA应用于鱼疖病的诊断,灵敏度达102CFU/mL。Kumar等建立了快速检测水产品中副溶血弧菌的ELISA方法。吴晓春等以鱼肠道弧菌为抗原制备多克隆抗体,用ELISA法来检测对海水鱼造成危害的弧菌属致病菌,灵敏度可达到每孔105CFU/mL。

1.3.2免疫层析技术传统ELISA技术操作繁琐、耗时长,限制了其在养殖场现场检测中的应用。目前,研究工作者将免疫层析技术应用于快速检测,如侧向层析技术(lateral-flowtechnology,LFT)被用于快速检测试纸条的研发。与传统检测方法相比,该检测技术具有快速、简便、价格低廉等优点。LFT的原理与ELISA相似,以固定了捕获蛋白(通常为抗体或抗原)的硝酸纤维素膜作为基板,采用乳胶、胶体金、碳以及新型材料(上转磷光或量子点)作为标记物对抗体或抗原进行标记,其检测结果可以用肉眼直接观测。目前已商业化用于诊断的免疫层析试纸产品大多为以纳米级胶体金颗粒为标记材料。此技术操作简便,一般5~15min就可得到结果,已广泛用于药残检测、食品安全、临床诊断中,也有用于水产养殖品种病害检测的报道。Sithigorngul等制备了抗哈维氏弧菌的鼠单克隆抗体和羊多克隆抗体,将这两种抗体用于胶体金免疫层析试纸条的制备,结果表明样品检测量只需100μL,针对哈维氏弧菌的检测限可达106CFU/mL以上,而检测时间小于15min。秦璞等利用胶体金免疫层析技术研制了一种快速检测迟钝爱德华氏菌的试纸条,该试纸条对迟钝爱德华氏菌有良好特异性,5~10min就可以得到检测结果,敏感度达到105CFU/mL。近年来,出现了基于新型材料和免疫层析技术,如目前报道较多的有量子点(quantumdots,QDs)、上转磷光(up-convertingphosphor,UCP)、纳米磁珠、荧光微球等标记抗体的免疫层析。其中量子点与抗体偶联后用于免疫层析显示出良好的稳定性和荧光强度,在人类病原菌检测上已经有所应用。Tully等初步建立了一种以量子点标记抗体检测李斯特单增杆菌(Listeriamonocytogenes)表面蛋白InlB,检测限可以达到12ng/mL。上转磷光材料则因其背景干扰小、灵敏度高等特点,被应用于耶尔森氏菌和布鲁氏菌的检测中,其灵敏度是胶体金免疫层析技术的10倍。目前,以上新型材料还未见用于鱼类病原菌检测的报道,但这些材料在未来检测试纸条研制中显示出良好的应用前景。

1.4芯片技术

随着近年来生物芯片技术的发展,以及病害检测对大规模、高通量的要求,芯片技术越来越多被用到病原菌的检测中。其中,应用最多的是基因芯片和蛋白芯片技术。基因芯片技术可以高通量、平行化对多种靶基因进行准确鉴定,为菌种鉴定提供了技术平台。Panicker等也通过多重PCR与DNA芯片相结合建立了一种主要针对创伤弧菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌检测沿海水域和甲壳类动物中的致病弧菌的方法,检测灵敏度为102~103CFU/mL。蛋白芯片又称蛋白微阵列,蛋白芯片是将各蛋白有序排列固定在载体上,之后用特异性标记的抗体或抗原蛋白与微阵列作用,经过扫描后确定蛋白间是否有相互作用。与基因芯片相比,蛋白芯片的研究仍处于摸索阶段。究其原因是由于蛋白质分子本身结构功能的复杂性与特殊性造成的。目前蛋白芯片用于水产养殖细菌性病害检测的报道较少。

2现有海水养殖细菌性病害检测方法的利弊及发展方向

综上所述,目前已报道多种海水养殖细菌性病害的检测方法,这些方法各有优缺点,相比较而言,基于细菌富集培养及生理生化指标检测的方法耗时、费力、精度和可靠性有限;基于分子生物学技术的检测方法虽然灵敏度高、特异性强、快速准确,能够检测出样品中的微量核酸,但是需要特定仪器设备并由专业技术人员操作,无法应用于基层养殖单位;基于免疫学技术ELISA检测方法操作流程耗时繁琐,无法实现对样品的实时检测。目前广泛采用的胶体金免疫层析技术虽然操作简便、耗时短、不需要专业技术人员操作,可以用于基层养殖场现场检测,但灵敏度不够高,导致一些发病症状不明显或特异的病害无法在感染初期检出并采取有效措施;基因芯片可高通量并行检测,人为操作的误差小,然而也存在价格昂贵等缺点。蛋白芯片技术虽然有着高特异性、高通量的特点,然而蛋白质结构复杂,合成困难,且蛋白较DNA更脆弱,易变性失活从而影响其性质和功能。

如何选择有效的水产病害检测方法,应根据施用单位的情况而异。对于具有一定实验室条件的水产品检验检疫单位或大型养殖企业,可以采用分子生物学技术,辅助以生理生化检测手段,实现常规样品的检测。对于大量样品,则可采用芯片技术进行高通量检测,用于病害预警或附加值较高的水产品食品安全检测。由于芯片制备复杂且检测设备成本较高,影响了该技术的推广。开发低成本芯片制备技术同时降低检测设备成本是今后的发展方向。针对基层养殖单位或个体养殖户,免疫层析试纸条因其操作简单快速,携带方便而显示出极大的优势,但该技术灵敏度有限,无法实现病害感染早期诊断,限制了其在海水养殖细菌性病害检测方面的进一步应用。制备具有更好亲和力的单克隆抗体,采用新型抗体标记材料配合相应的便携式荧光读取器,不仅有助于免疫层析试纸条灵敏度的提高,还可以用于病害的半定量分析及多元化检验。目前已有研究人员研制出灵敏度是胶体金免疫层析试纸条10~100倍的免疫层析试纸条,虽然还处于实验室阶段,且生产成本还有待进一步降低,但相信未来此类产品将成为广大养殖基层单位病害检测的主流产品。

作者:肖婧凡王玥张元兴雷霁霖单位:华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室中国水产科学院黄海水产研究所

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