水稻生物技术的展望范文

1组织培养

1.1用组织培养的方法筛选耐盐碱水稻突变体的研究吉林省西部有大量的盐碱地，为充分挖掘西部盐碱地水稻产量潜力，选育耐盐碱的水稻新材料也是吉林省水稻工作的重点研究内容。延边大学林延玉通过逐步提高培养基pH值的方法，对长白9号、珍富19、通35、延农1号等4个水稻品种进行愈伤组织的耐盐碱突变体筛选。研究表明，珍富19的愈伤组织出愈率、出苗率、存活率以及农艺性状等方面均要优于其它3个品种，其再生植株耐盐碱性优于原品种种子植株。再生植株耐盐碱性与愈伤组织耐盐碱性有一定的关系，但也有一些差异。在种子萌发期，长白9号再生植株当代种子耐盐碱性优于原品种种子，而再生植株当代种子2叶期幼苗耐盐碱性不如原品种种子植株的2叶期幼苗，通35则相反。同时，对再生植株盐碱鉴定条件也进行了研究。研究表明，种子萌发时期用19000mg/kg的NaHCO3溶液来进行，2叶期幼苗用16000mg/kg的NaHCO3溶液来进行，则鉴定效果较好。

1.2水稻耐冷突变体细胞系及其无性系研究吉林省作为东北粳稻主产区，每隔4～5年都会经历一次低温冷害，对吉林省粳稻的稳定生产造成一定影响。针对于此，吉林省农科院水稻所开展了水稻耐冷组培研究。金润洲等1986年在来自粳稻种胚的愈伤组织中，用-3℃处理15～20d的方法，经多次选择，获得过耐冷愈伤组织系，但没有分化出再生植株。金润洲等将来自粳稻11个品种幼穗的愈伤组织，在15℃下继代培养，每隔5d调查愈伤组织块的直径，发现在15℃冷温下，第15～30d的愈伤组织净生长量与供体品种孕穗期的耐冷性呈显著的正相关。其中第25天的相关系数最大，达到1%极显著水平(0.757**)。因此，提议在15℃下培养25d的愈伤组织净生长量作为鉴定愈伤组织耐冷性的指标，在15℃下培养25d的方法，作为愈伤组织耐冷性的鉴定方法及选择技术。用这种方法，经多次重复选择，获得了耐冷愈伤组织及其再生植株。同时，金润洲等探讨了氯酸钾、聚乙二醇(PEG)、升汞等化学物质对愈伤组织生长的影响及其与品种耐冷性的关系。结果，在含有0.4%氯酸钾的培养基上4个耐冷品种的愈伤组织35d后的平均净生长量明显大于5个敏感品种的平均值，大块率(>5mm的愈伤组织块占供试总块数中的百分比)达39.3%，比敏感品种高3.7倍。说明来自耐冷品种的愈伤组织抗毒性明显高于来自敏感品种的愈伤组织。1988年金润洲等对未作任何因子处理的培养基中获得的体细胞无性系自交二代(R2)进行了孕穗期耐冷性鉴定试验，首次获得了耐冷性明显超亲的体细胞无性系26份，首次证明了组织培养本身就是一种有效的耐冷性诱变技术。同时，从愈伤组织的生长量和绿苗分化率两个方面对耐冷性的遗传稳定性也进行了相关研究。愈伤组织的生长量:1987年金润洲选用来自粳稻品种秋光(愈伤组织生长慢)和吉粳44号(生长快)种胚的愈伤组织，连续培养4代(每代30d)。结果无论在哪一个世代，生长快的吉粳44愈伤组织大块率(在供试的愈伤组织总块数中，直径>8mm的块所占的百分比)总是多于生长慢的秋光愈伤组织。在另一组试验中，在15℃培养温度下来自11个粳稻品种幼穗的愈伤组织生长量与供体品种孕穗期的耐冷性呈极显著的正相关。即来自耐冷品种的愈伤组织生长量明显大于来自不耐冷品种的愈伤组织生长量。说明愈伤组织生长量是与品种耐冷性有相关性的相对稳定的遗传性状。绿苗分化率:金润洲的试验结果，来自幼穗的愈伤组织绿苗分化率与供体品种的孕穗期耐冷性呈显著的正相关。即品种耐冷性越强，其愈伤组织的绿苗分化率则越高。从杂种一代的绿苗分化率来看，在供试的6个杂交组合中5个组织的杂种一代绿苗分化率明显高于不耐冷亲本的绿苗分化率，相等或稍高于耐冷亲本。认为绿苗分化率是受显性基因控制的较稳定的遗传性状。

2分子标记技术研究

2.1分子标记辅助育种和种质渐渗研究利用基因组特异性分子标记可以检测和促进有利基因从水稻野生种或其它物种向水稻栽培种的渐渗。朴亨茂等将菰等植物的DNA通过花粉管通道法导入水稻中，后代材料中获得了多个具有优良特性的水稻材料。然而菰遗传物质渐渗给水稻的直接证据缺乏。刘振兰等以菰和水稻的基因组DNA为探针，通过点杂交，获得了2个菰物种专化DNA序列。并以这两个序列为探针，与渐渗杂交系进行杂交分析，分析结果为菰导入水稻提供了确凿的证据。初秀成等将柳叶菜科植物月见草(Oenotherabiennis)导入水稻品种通育211中，对D3-6代中代表性变异材料进行了AFLP分子标记分析，证明月见草的花粉介入确定使受体水稻在DNA分子水平上产生了大量的变异，但要确证这些材料中是否含有直接来自月见草的遗传物质，还需要进行更深入的分子分析。

2.2遗传连锁图谱的绘制利用分子标记可绘制遗传连锁图谱，用于重要农艺性状基因在染色体上的定位。祁栋灵等以粳粳交“高产106/长白9号”的F2-3代200个家系为作图群体，以SSR标记构建的分子连锁图谱为基础，对水稻幼苗前期的根数、根长和苗高及其相对碱害率进行了数量性状基因座(QTL)的检测。研究表明，上述性状在F3家系群中均表现为具有1～2个峰的连续分布，认为由主效基因和微效基因共同控制的数量性状。共检测到与碱胁迫下幼苗前期根数、根长和苗高及其相对碱害率相关的QTL26个，分布于第1、5、6、7、8、9和11染色体上。其中，碱胁迫下与根数相关的QTL4个，qRN6-1和qRN11对表型变异的解释率较大，分别为29.91%和13.42%；与根数相对碱害相关的QTL5个，qRRN11-2对表型变异的解释率较大，为23.86%；与根长相关的QTL6个，QR-RL11-2对表型变异的解释率较大，为21.06%；与根长相对碱害率相关的QTL2个，但对表型变异的解释率均较低；与苗高相关的QTL5个，QSH1和QSH11-2对表型变异的解释率较大，分别为15.81%和16.53%；与苗高相对碱害率相关的QTL4个，QRSH5和QRSH6-2对表型变异的解释率分别为29.89%和34.63%。而这些解释率较大的QTL所处的标记区间距离，除QRN6-1相对较小(19.0cM)外，其余QTL的标记区间距离均大于26.3cM，需作进一步的精细定位。在所检测到的QTL中，13个QTL的增效等位基因均来自耐碱亲本长白9号，而其余QTL的增效等位基因来自敏碱亲本高产106；基因的主要作用方式为超显性或部分显性。

3转基因研究

3.1抗病转基因研究抗病转基因研究一直是水稻转基因研究的重点。林春晶等将溶菌酶基因通过基因枪轰击法转入水稻品种超产2号和丰优201中，R1代群体材料中转基因植株的发病指数要低于对照，外源基因的转入提高了水稻植株对稻瘟病的抗性水平。于彦春利用农杆菌介导法，将两个抗白叶枯病基因CECROPINB和XA21导入水稻品种JY119株系，获得了这两个基因的单独和共表达后的植株。接种3个不同白叶枯病菌后观察转基因植株与对照JY119株系发现，不论是单基因转化，还是共转化，转基因植株均表现为比较明显的抗性。从接种后发病的病斑长度来看，共转化植株产生高抗白叶枯病的可能性要大于转单抗白叶枯病基因材料。刘雪辉将浙江大学获得的转RCH10和AGLU1基因的抗纹枯病株系的遗传稳定性及抗病性进行了分析。研究发现，在T6代中，NPTII基因全部得到保留，而15%的植株发生RCH10基因或AGLU1基因的丢失，其中1株被检植株甚至丢失了RCH10和AGLU1双基因。保留RCH10和AGLU1双基因的T6转基因植株在接种纹枯病菌后抗性均高于野生稻。刘瑞芳利用农杆菌介导法将水稻转核糖体失活蛋白基因导入水稻品种丰优307、富源4号和吉粳88中，获得抗性苗32株。采用离体叶片接种法对转基因植株进行初步稻瘟病抗性鉴定，发现外源基因的转入提高了水稻植株对稻瘟病的抗性水平。

3.2抗虫转基因研究林秀峰等利用农杆菌介导法，将苏云金杆菌素毒蛋白基因CRYIA和半夏凝集素(PINELLI-ATERNATAAGGLUTININ，PTA)基因转入水稻品种吉粳81、吉粳88和通887中，用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。水稻二化螟接虫鉴定结果表明，23株转基因植株抗虫性比对照明显提高，2株表现感虫。总体来讲，转基因水稻比对照的抗虫性明显提高。

3.3抗除草剂转基因研究王景余等应用基因枪法将抗除草剂基因(BAR)导入吉林省主栽水稻品种长白8号中，获得了抗除草剂转基因水稻植株。除草剂叶片涂布试验，有3个转基因水稻植株仍为绿色，表现对Basta除草剂有抗性，说明在阳性转基因植株中抗除草剂基因整合到水稻基因组中并得到表达，使转基因水稻植株产生抗性。

3.4生物反应器植物生物反应器是指利用植物悬浮细胞培养或整株植物为工厂生产具有重要功能的蛋白质，如：人或动物的疫苗、抗体、重要的氨基酸、具有重要药用价值的蛋白或食品添加剂、工业原料的植物次生代谢产物等。目前，以水稻作为生物反应器在生产疫苗、工业酶制剂和工业可降解塑料及一些重要的药用蛋白等研究已经取得了很大进展。张秀香以鹦鹉热衣原保护性抗原基因momp基因和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位ltb基因为研究对象，分别构建了表达MOMP基因和LTB-MOMP融合蛋白的原核表达载体，通过农杆菌介导法，将ltb-momp融合基因导入水稻植株中，通过抗性筛选及整合性鉴定，证明获得了表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株。维生素A(VA)是人体必需的营养元素，人体不能合成类胡萝卜素，主要依赖饮食中类胡萝卜素的供应，其中β-胡萝卜素是其主要前体。目前为止，还未发现水稻胚乳能合成维生素A原的水稻栽培品种。王纪报选用植物类胡萝卜素遗传工程中的首选基因PSY以及编码HIV-1病毒外膜蛋白的gp120基因作为目的基因，以水稻成熟胚诱导的愈伤组织为受体，分别通过农杆菌介导和基因枪转化的方法将目的基因导入水稻，对获得的抗性苗进行PCR、PCR-Southern检测表明，目的基因已经整合到水稻基因组中。

3.5其它水稻转基因研究管清杰利用RT-PCR技术，从水稻品种吉玉粳中克隆到水稻抗坏血酸过氧化物酶(APXa)目的基因片段。并将其转入烟草中，获得8株转基因植株；杨柏明首次克隆了短芒大麦的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因HbNHX1，并利用农杆菌介导法将其转入水稻中，获得20株转基因植株，为水稻抗逆遗传改良提供了新材料。

4表观遗传学研究

申斯乐等用高压诱变水稻，并对变异品系的DNA甲基化模式和基因组结构进行了研究。通过对原种及两个变异品系基因组DNA分析，显示原种及两个变异品系不仅存在着基因组结构的变异，而且发生了DNA甲基化模式的改变。此外，研究发现原种和两个变异品系异地栽种，其形态水平的变异可以稳定表达。范建成等研究了萘胁迫对水稻基因组DNA甲基化模式的影响。运用MSAP技术测定水稻纯系品种日本睛和松前经萘染毒胁迫后，不同生长时期叶片基因组DNA甲基化变异的情况。水稻经萘胁迫后存在基于DNA甲基化水平和模式改变的表观遗传变异；5-甲基胞嘧啶百分含量的变化无统一趋势或规律；全部检测到的1051个位点中，日本睛有16.56%发生了变异，相对于松前的12.08%具有显著差异，一定程度上说明抗萘胁迫能力与基因型有关：松前强于日本睛；不同基因型及不同生长时期DNA甲基化模式的变异存在明显差异，表现为以去甲基化为主(0.48%～10.41%),由此推测DNA去甲基化可能是植物抗萘胁迫机制的一部分。

5基因克隆及功能验证

赵增琳用PCR方法从水稻基因组中克隆了单加氧酶基因，构建原核表达载体，使之在大肠杆菌中得到表达。并通过吲哚生成靛蓝实验测定单加氧酶活性，以空载体为对照，单加氧原核表达蛋白活性明显增强；构建真核表达载体，转化拟南芥，发现转基因拟南芥能够耐受50℃高温及UV-B紫外线辐射。李世鹏用PCR的方法克隆了两个水稻I型金属硫蛋白基因启动子，将其分别插入pCAMBIA1381载体，构建了启动子与GUS基因双元表达载体，转化拟南芥，对其进行了功能分析。

6问题与展望

目前，吉林省在水稻基因工程育种方面已取得不少进展，但是还缺乏基因的高效发掘技术，实用分子标记也较少，许多重要目标性状基因尚需紧密标记。同时，水稻组织培养技术存在一定的缺陷，比如出愈率、绿苗分化率都还不够高，影响后代基因型的充分表达，因此有待于在应用中进一步完善。加强基础研究，弄清楚细胞脱分化和发育的分子机制。加快基因工程与细胞工程的整合，并进一步完善技术体系。

作者：王金明林秀云孙强单位：中国农业科技东北创新中心吉林省农科院水稻所