大豆分子育种研究范文

《中国农业科技导报》2014年第四期

1高通量测序技术在大豆功能基因组学中的应用

高通量测序技术已广泛应用于大豆种质资源分析和基因资源挖掘中，涉及的技术领域包括基因组重测序、转录组分析、miRNA鉴定等，对深入研究大豆功能基因组学发挥了巨大作用。基因组重测序技术已成为研究大豆基因组遗传变异规律的有效方法之一。Li等采用该技术对野生大豆和栽培大豆的进化选择过程进行了研究，结果表明：在从野生大豆向栽培大豆的演变过程中，人工选择发挥了很大作用，其表现之一是降低了大豆的遗传多样性。该研究所提供的基因资源和信息也将促进大豆重要农艺性状相关的基因挖掘。Wong等利用RNASeq技术对大豆成花诱导过程中叶片和顶端分生组织转录组的变化进行了分析，发现生长素、细胞分裂素、赤霉素等植物激素代谢调控途径与成花启动具有密切关系。在抗逆性研究方面，Ali等利用Tag测序技术比较了耐盐型野生材料STGoGS和盐敏感型栽培品种SSGoGM在盐胁迫下的转录组变化，发现大豆可通过ABA合成、基因转录的调控和信号转导来响应盐胁迫；Le等通过研究干旱胁迫下大豆叶片转录组的变化，发现了大量抗旱相关基因；Vidal等通过比较两个抗旱性迥异品种的转录组，发现了一些抗旱多态性位点。这些研究结果表明，高通量转录组分析技术可有效地应用于大豆新基因发现和新分子标记的开发。高通量测序技术的应用还大大加快了miRNA的发现过程。Wang等通过高通量测序详细地分析了大豆低氮反应中miRNA的相互调控关系。Shamimuzzaman等对大豆种子发育过程中由miRNA介导的剪切降解片段进行深度测序，发现了53个miRNA，并初步确定了其所作用的180个靶基因。随着测序成本的降低和海量数据处理能力的加强，高通量测序技术将会被更多地应用到大豆基因组学研究中，为大豆新基因的挖掘和分子育种带来革命性的变革。

2大豆新基因发掘进展

近年来，大豆生长发育分子机制研究取得了显著成绩。Xia等发现E1编码一个潜在的转录因子，其与GmFT2a和GmFT5a的表达呈现拮抗关系，抑制植株开花。Jiang等发现GmFT2a的启动子区域存在多态性，但这种多态性与生育期多样性关系不大，认为大豆品种的生育期分化主要与GmFT2a的转录调控有关。Na等［12］克隆了大豆中的GmSOC1like基因，基因表达分析和百脉根遗传转化实验证明该基因是大豆中的开花诱导基因。Luo等发现一年生野大豆（Glycinesoja）中的WRKY家族基因GsWRKY20可能通过调节开花相关基因（FLC、FT、SOC1、CO）的表达正向调控开花。Zhao等发现大豆中编码GAMYB结合蛋白的基因GmGBP1与开花有关。在长日照条件下，该基因在拟南芥中异位表达能够通过光周期途径和赤霉素途径改变CO、FT、LEAFY和GAMYB的表达促进开花，而在短日照条件下，GmGBP1则通过自主途径改变FLC和SVP的表达进而抑制开花；同时，GmGBP1还能够增强植株的耐热性和耐旱性，降低耐盐性。D1和D2是STAYGREEN（SGR）在大豆中的同源基因，它们的表达促进叶绿素的降解和细胞程序性凋亡相关基因的表达，上述基因的突变是造成大豆成熟时叶片持绿和种皮绿色的原因［15］。Meng等［16］发现大豆中的蓝光受体CRY2a能够与转录因子ClB1相互作用抑制衰老相关基因（例如WRKY53b）的表达从而延缓叶片衰老。在结瘤研究方面，Radwan等［17］发现1433蛋白SGF14c和SGF14l在大豆结瘤前期有重要的作用。Qin等［18］分离了一个与根瘤高亲和的磷转运基因GmPT5，其编码的蛋白能将磷从根的维管束系统运输到根瘤，尤其是在磷有限的条件下，GmPT5对大豆结瘤和根瘤生长有重要的调控作用。在农艺性状相关研究方面，Jeong等克隆了大豆叶型和荚粒数控制基因Ln，该基因是拟南芥JAGGED（JAG）的同源基因，参与叶型的控制和果实的发育，与大豆荚粒的形成有关，该研究为大豆高产育种提供了有价值的基因资源。在大豆抗病性研究方面，Liu等和Cook等分别克隆了大豆抗胞囊线虫基因Rhg4和Rhg1。Rhg4编码一个丝氨酸羟甲基转移酶，参与植物体内叶酸的代谢。Rhg1位点由3个抗性相关基因组成，Rhg1基因拷贝数的增加导致基因表达量升高，从而使大豆获得对胞囊线虫的抗性。在大豆抗逆性研究方面，Luo等发现来自一年生野大豆的GsWRKY20基因在拟南芥中的异位表达大大增加了植株的抗旱性。Xu等从大豆中分离了12个分子伴侣GmHsp90基因，这些基因在叶片中表达，并且会受到高温、高渗透压和盐胁迫的强烈激活，而对冷胁迫不敏感。此外，研究人员从栽培大豆和野生大豆中分离到的GmDREB2A；2、JAZ家族基因GsJAZ22和GsZFP12基因都与非生物胁迫反应相关。

3大豆分子标记辅助选择研究进展

近年来，在分子标记的开发和应用方面更加注重利用新的连锁分析方法挖掘与重要性状相关的位点，为更好地了解大豆遗传机制和新基因的克隆奠定基础。Ha等利用KeunolkongxSinpaldalkong重组自交系研究了种子表皮破裂性状在4个环境下的QTL及其环境效应。Yang等利用东农594和Charleston杂交形成的重组自交系研究11种环境条件下控制大豆籽粒性状QTL的加性与上位性作用，确定了主效QTL和不同效应的QTL，为更好地进行标记辅助选择提供了基础。以往的研究已定位了多个性状的QTL位点，但真正应用于育种实践的却很少，主要是因为QTL位点定位多采用一个群体，所定位的QTL位点易受遗传背景影响，所以近年的研究尝试用多群体、染色体片段置换系（chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSL）群体和回交群体等，以期找到不受群体背景影响的位点。Pathan等利用公共亲本Magellan分别与PI438489B和PI567516C杂交，构建了包含216和156株系的重组自交系，发现7个与蛋白含量相关的位点、6个与油分含量相关的位点和4个与产量相关的位点，其中位于第6号染色体上的位点还与种子百粒重相关。关联分析的发展为有效发现、评价和利用分子标记提供了强有力的工具。在开花期相关位点的研究方面，Zuo等利用118个SSR标记来分析了两年试验中275个大豆品种的光温敏感性，得到一系列与光温反应相关的位点。Niu等利用来自中国6个生态区的257个品种来分析与大豆籽粒形状相关的性状，找到了一些有价值的变异位点。Korir等以分别来自中国黄河和长江流域的188个品种和184个KFNo．1xNN11382重组自交系为材料，对大豆的耐铝性遗传机制进行研究，用连锁分析和关联分析两种方法共同定位到了11个位点，其中Satt209、Sat＿364、Sat＿240、Sct＿190和Satt284标记在以往的研究中也被证明与耐铝性相关。两种方法共同定位的标记很有可能位于耐铝性基因的候选区域。随着功能基因的挖掘、分子标记的增加和检测效率的提高，分子标记辅助育种技术正向自动化方向发展。Song等在测序基础上发展了含有高密度SNPs的大豆基因芯片SoySNP50KiSelectSNPBeadchip，为分子标记在大豆遗传多样性分析和高通量连锁图谱构建等方面的应用提供了强有力的工具。目前，基因芯片技术已经应用于大豆抗蚜性，蛋白质和脂肪含量等方面的研究。一些生物技术公司已实现大豆分子标记技术的高度自动化，将其广泛应用于杂交后代筛选和品种纯度检验。结合测序的分子标记技术为全基因组功能标记、非功能标记的开发及品种全基因组档案建立奠定了基础。

4大豆转基因育种研究进展

目前，商业化种植的转基因大豆品种除具有耐除草剂的特性外，还出现叠加高产、优质、抗病等新性状的材料。过去两年中，大豆转基因技术也得到进一步优化，转化效率不断提高。

4．1大豆遗传转化体系优化根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导的大豆遗传转化是大豆转基因育种中应用最早和最广泛的方法。该方法对目的基因分子量大小和外植体种类的限制小，导入基因的拷贝数低，外源基因整合完整，遗传稳定，表达效果好。早在1988年，Hinchee等就用这种方法得到了大豆转基因植株，证明该方法在大豆遗传转化中应用的可行性。然而，由于农杆菌介导法的转化效率受到农杆菌菌株转化侵染能力、大豆基因型、组织培养条件、TDNA转移效率和转化后筛选模式等因素的影响，目前转化效率仍然不高。因此，国内外学者一直在进行对该方法的改进和优化工作。Song等从20种中国大豆品种中筛选到了3个转化效率较稳定的大豆品种粤春045、粤春033和天隆1号。郝荣华等从13个大豆品种中筛选出适合子叶节转化的山宁14，优化后的转化效率可到3．2％。盖江南等［39］利用大豆幼胚进行不定胚诱导进而建立了大豆悬浮培养不定胚繁殖体系用于基因枪转化。另外，李永光等建立了一种新型农杆菌介导的大豆不定胚原位诱导转化法，通过去除萌发大豆的顶芽及侧芽，轻划伤口后滴入菌液进行侵染，通过不定芽分化最终得到抗性植株。应用于大豆遗传转化体系的传统筛选剂有卡那霉素、潮霉素和草胺膦等，近期也有一些关于其他筛选剂报道。岳岩磊等和张敏等分别探索了草甘膦和灭草烟的筛选效果，认为这两种筛选剂也具有较好的应用前景，从而拓宽了筛选剂的选择空间。

4．2大豆转基因品种选育转基因技术在改良大豆品质、耐除草剂、抗病性、抗逆性等方面取得了新的进展。美国孟山都公司推出的高油酸大豆，其油酸含量比目前任何商业化种植的大豆品种都要高。此外，抗麦草畏、高产、抗虫高产、高Ω3亚麻酸、高γ亚麻酸（GLA）、高油等类型的转基因品种已经或即将上市。在抗病虫大豆新材料创制方面，Youssef等发现过表达AtPAD4（PHYTOALEXINDEFICIENT4）的大豆复合体植株对大豆胞囊线虫（soybeancystnematode，SCN）及根节线虫（rootknotnematode，RKN）的抗性均有所提高；在导入水杨酸甲基转移酶基因GmSAMT1的大豆发状根以及导入大豆胞囊线虫果糖1，2磷酸酶沉默载体pRAPHgALDRNAi的大豆复合体植株［45］中，SCN的发育受到阻碍；过表达抗虫基因cryIA的大豆品种东农50对食心虫的抗性明显优于对照。在抗逆育种研究方面，转入水稻脱水应答转录因子OsDREB2A和过表达GmNFR5a的转基因大豆耐盐性有所提高；转入烟草渗调蛋白基因Tbosm的大豆植株不仅耐盐性有所改善，而且对白粉菌、褐纹病菌和大豆锈菌的抗性也有所增强；过表达盐芥肌醇磷酸激酶基因ThIPK2的大豆在耐旱、耐盐以及抗氧化能力方面均有所提高。在品质改良方面，Song等将拟南芥胱硫醚γ合成酶基因AtDCGS转入大豆，提高了籽粒蛋氨酸的含量；Kim等将O乙酰丝氨酸巯解酶基因OASS转入大豆，提高了籽粒中与蛋白质结合的半胱氨酸和游离半胱氨酸的含量。以上研究为培育抗病、抗逆、优质转基因大豆品种奠定了基础。2013年，中国农业部为巴斯夫农化有限公司申请的抗除草剂大豆CV127、孟山都远东有限公司申请的抗虫大豆MON87701和抗虫耐除草剂大豆MON87701×MON89788发放了农业转基因生物安全证书，允许其进口用作加工原料。其中，CV127已在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、新西兰、菲律宾、墨西哥、哥伦比亚、俄罗斯、南非、巴西和阿根廷等国家获得批准用于商业化种植或食用；MON87701已在美国、加拿大、日本、欧盟和墨西哥等国家或地区批准用于商业化种植或食用；MON87701×MON89788已在欧盟、韩国、墨西哥、阿根廷、巴西和巴拉圭等国家或批准用于商业化种植或食用。可见，转基因大豆新品种的商业化种植及应用已成为全球化的发展趋势，因此提高我国转基因大豆自主研发能力已刻不容缓［54］。

5展望

2012－2013年，国内外大豆分子育种取得了较大进展，并呈现出新的发展趋势，今后应更加注重以下领域的研究：高通量测序技术在大豆种质资源分析和基因资源挖掘方面的应用；具有重要利用价值的基因的挖掘；关联分析方法在基因定位方面的作用；多时期、多环境、多遗传背景条件下大豆重要性状QTL的挖掘；复合性状转基因大豆品种的培育。与水稻、玉米等作物相比，目前大豆的基因组学研究相对滞后，具有实用价值的分子标记较少，遗传转化效率偏低，限制了大豆分子育种工作的发展。今后，需要进一步加强大豆功能基因组学研究，深入解析重要经济性状形成的分子机制，挖掘有育种价值的新基因和分子标记，进一步提高大豆分子标记辅助育种的通用性、自动化水平和转基因育种的效率，实现分子育种与常规育种的有机结合。作为世界上最大的转基因大豆进口国，我国应该大力加强大豆分子生物学研究，推进生物技术在大豆育种中应用，提高自主研发能力，早日实现生物技术改良品种的生产应用。

作者：曲梦楠蒋炳军刘薇毛婷婷马立明林抗雪韩天富单位：东北农业大学农学院中国农业科学院作物科学研究所