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锌离子响应水凝胶的制备

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《中国科技论文杂志》2015年第二十二期

摘要:

为了制备含有咪唑基团的水凝胶,本文将反应制备的Im-PAA-HEAA大分子单体和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)混合,在紫外照射下发生自由基反应,从而得到Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶。在低浓度的锌离子溶液刺激下,水凝胶表现出体积收缩、吸水率下降和强度增强等响应性,并且表现出良好的细胞相容性。将尿刊酸接枝于聚乙烯亚胺(PEI),制成含咪唑的非病毒基因载体(Im-PEI),该载体可以有效复合pDNA,并具有低细胞毒性和较高的转染效率。利用锌离子和咪唑之间的络合作用,可以将Im-PEI/DNA复合物有效地固定于Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶表面。研究结果表明:与无锌离子作用相比,Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶在锌离子作用下能够吸附更多的Im-PEI/DNA复合物,该水凝胶有望在反向基因转染方面得到应用。

关键词:

水凝胶;咪唑;锌离子响应;基因转染

水凝胶是通过化学或物理交联使亲水聚合物链聚集而形成的三维网状结构[1],可以迅速吸收并保持大量水分,而又不溶于水,是集吸水、保水、缓释于一体的功能高分子材料。图1为水凝胶的网络示意图[2]。水凝胶因兼具高含水量与活动性,结构类似于生物体,表现出优良的生物相容性,可应用于组织工程、药物传递、生物传感器等领域[3-4],其中在生物领域应用更加广泛,反向基因转染就是一个重要方面的应用。目前,对于一些对人类健康构成严重危害的疾病,如心血管疾病,恶性肿瘤,感染性疾病(如艾滋病)和遗传性疾病(如先天免疫缺陷、血友病)等,医学上传统治疗方法存在很大的局限性,与之相比,基因治疗有着极大的优势。1989年,科学家成功将腺嘌呤脱氨酶(ADA)基因导入患者体内的T淋巴细胞,治疗了ADA基因缺失病,标志着基因治疗时代的开始。基因治疗要求基因运输系统有效、可控,涉及材料科学、生命科学、临床医学等多学科领域。基因治疗最关键的环节是选择基因转染所用的载体,它是将用于治疗的目的基因输送到病患体内靶细胞的工具,分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率非常高,但目的基因的携带量小,基因与载体组装的难度大、成本高,转染可控性差,具有高自身免疫原性和潜在致癌危害性,还有造成细胞病理改变的可能,因而其应用受到了很大限制。非病毒载体不含病毒基因和蛋白成分,所以不具有病毒载体的高自身免疫原性和潜在致癌性,且具有基因容量大、化学结构可设计控制,以及大量制备方便、成本低等优点,引起学界越来越多的关注。

非病毒载体有阳离子脂质体、阳离子高聚物和多功能纳米材料等。非病毒载体进行基因转染的普遍的方法是阳离子高聚物或脂质体通过与DNA的静电作用形成纳米级复合物。将装载有目的基因的复合物溶液加入到细胞培养基中,复合物沉淀到贴壁细胞的表面,由宿主细胞通过胞吞作用吸收目的基因,之后目的基因所含DNA在细胞内表达。这种方法需要控制较低的复合物溶液浓度,否则生物相容性差,会表现出毒性。而且复合物在溶液中处于流动状态,比较分散且不在固定位置,复合物与靶细胞的接触机会受到限制。这些都造成非病毒载体的转染效率低,因此提高转染效率是非病毒载体应用的关键。为了解决上述问题,近年来提出了一种反向转染(reversetransfection)方法,用固态材料吸附DNA或载体/DNA复合物,让其与靶细胞的溶液接触,实现转染。这种方法的转染过程在固定位置进行,可以实现目的基因在靶细胞所处的位置原位释放。而且靶细胞接触的目的基因量比较大,接触机会和转染效率得到提高[5]。Shen等[6]将DNA沉积到无机矿物质表面制成复合物纳米材料,材料表面能够提供生物相容性好的环境,DNA浓度也高。转染效率可以通过调节无机矿物质的组分来调节,最佳转染效率可以与市面上出售的化学药剂的商品化脂质体相当。Rea等[7]以载体/DNA复合物吸附蛋白进行转染,并经过研究发现蛋白的种类影响载体复合物的固定和进入细胞后转运的途径,表面吸附蛋白可以促进细胞内吞作用,提高转染效率。水凝胶是一种适合作为反相转染的介质,对基因转染用水凝胶的研究也开展得比较多。

Segura等[8]合成了一种可降解的透明质酸/胶原基水凝胶,能够通过物理作用和生物素结合作用,吸附PEI载体/DNA复合物,进行反相基因转染,并且能够实现控制释放。这种凝胶还可以设计固定的图案,将图案以外的部分遮蔽,使靶细胞在与凝胶接触时沿图案的方向生长,并沿这一方向在固定的区域内被转染。Rieux等[9]使用2种方法进行纤维蛋白原水凝胶介导基因转染:方法1,先将脂质体复合物和细胞培养30min,再加入到纤维蛋白原中混合并聚合;方法2,脂质体复合物直接与纤维蛋白原混合聚合,再将细胞接种到制成的凝胶的表面。经过分析研究,类似反向转染原理的方法2能够延长目的基因对靶细胞的表达时间,并且具有控释作用。以上研究表明,水凝胶适宜作为基因转染所用的固态生物材料,前景非常广阔。水凝胶如用作基因转染材料,要求其能够对DNA或载体/DNA复合物通过氢键或化学键等作用形成良好的吸附。智能水凝胶在响应刺激的情况下可以改变自身强度,在网络结构中引入新的化学键,为凝胶-载体-DNA的基因转染材质体系提供设计思路。

1Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶的制备与表征

水凝胶可以通过物理交联和化学交联制备。其中,采用物理交联法制备的水凝胶的力学性能比较差,而化学交联水凝胶则能够克服这一缺陷[1]。一般来说,高分子主链或侧链上含有大量的亲水基团和具有适当的交联网络结构是制备水凝胶的必要前提条件[10]。聚丙烯酸(PAA,相对分子质量为800)与N,N′-羰基二咪唑(CDI)和N-羟乙基丙烯酰胺(HEAA)反应制成Im-PAA-HEAA大分子单体,此大分子单体和PAA单体的1HNMR谱图如图2所示,从中计算得到HEAA的接枝率约为20%。以聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA,相对分子质量4000)为交联剂,2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Ir-gacure2959)为光引发剂,通过紫外光引发制成了大分子单体质量分数为10%、15%、20%的Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶。平衡含水量是水凝胶的重要基本指标之一,文中不同单体比例水凝胶的平衡含水量如图3所示。Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶的含水量很高,在磷酸缓冲盐溶液(PBS)环境中,单体比例(质量分数)为10%的水凝胶含水量可达92.13%(质量分数),而随着大分子单体含量的增加,水凝胶的含水量略有下降。这是由于在聚合的过程中,较高的大分子单体浓度会导致较高的大分子网络密度,从而阻碍水向凝胶中扩散,溶胀情况受到网络密度的影响。由于咪唑和锌离子的作用,锌离子处理后的水凝胶使网络更紧凑,网络密度增大,含水量比锌离子处理之前减少,单体比例(质量分数)为20%的水凝胶在经过锌离子处理后,平衡含水量也可以达到87.77%(质量分数)。不同单体比例的水凝胶经锌离子处理后的体积变化情况如图4所示,微量锌离子可以使水凝胶的体积收缩,锌离子浓度越高,水凝胶收缩越快。低浓度(10mmol/L)锌离子可以分别使单体比例为10%、15%和20%的水凝胶体积收缩至原体积的55%、62%和67%。单体浓度增加虽然使进入的锌离子与咪唑作用点和络合键更多,但是凝胶本身的网络密度也增大,具有一定刚性的PAA主链增多,网络结构更稳定且不易改变,络合作用使网络变紧凑。因此,单体比例为20%的水凝胶的网络密度增大的比率较单体比例为10%的水凝胶的小,因此随单体比例的增加,水凝胶的体积变化程度减小。经过5mmol/L的ZnCl2溶液浸泡1d之后,单体比例为10%、15%、20%的水凝胶的压缩强度如图5所示,图中数据表明凝胶的压缩强度由锌离子处理前的0.05、0.08、0.11MPa分别提高到锌离子处理后的0.135、0.145、0.26MPa。这些结果表明,在锌离子的作用下,水凝胶的压缩强度有了大幅度的提高。水凝胶中的咪唑环和锌离子有很强的结合作用,形成了络合键,增加了交联点,可以抵抗外界作用力,水凝胶的压缩强度因此得以提高。单体浓度越高,形成络合作用越强,交联点越多,水凝胶的压缩强度增大得越多。在水凝胶表面接种细胞,培养生长,之后用含5mmol/L锌离子的溶液浸泡4h,与对照组进行对比,观察细胞在水凝胶表面的生长情况。图6表示细胞在水凝胶表面的黏附情况,图中可以看到2组细胞都可以很好地在水凝胶表面生长,说明Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶在锌离子响应前、后都具有比较好的生物相容性。

2Im-PEI载体/pDNA复合物水凝胶的制备及反向转染应用

聚乙烯亚胺(PEI)是一种使用较多的阳离子高聚物非病毒载体,在1995年由Boussif等[11]研究报道。PEI在生理环境下就能质子化而带正电荷,吸附、包裹带负电荷的DNA。PEI具有“质子海绵”特性,靶细胞通过胞吞作用吸收载体/DNA体系,载体/DNA体系在胞吞作用下进入内涵体、溶酶体。在内涵体/溶酶体中,PEI能够吸附大量氢离子导致氯离子渗入引发内涵体溶胀甚至破裂,使PEI/DNA能够逃逸出来,实现表达而不会被降解[12]。用尿刊酸与CDI和PEI反应,合成的Im-PEI的核磁氢谱如图7所示,1HNMR谱图证明制成了接枝有咪唑基团的Im-PEI载体,该载体在复合pDNA后,可以通过锌离子的作用被水凝胶吸附从而进行反向转染实验(如图8所示)。pDNA分子为两性电解质,在中性或偏碱性条件下,pDNA的磷酸基团电离使核酸分子带负电荷,从而在外加电场中向正极泳动。由于PEI分子中含有大量氨基,使其带有正电荷,当向pDNA中加入PEI或Im-PEI时,随着加入量的增大,载体和pD-NA之间会通过库伦相互作用而发生坍塌缩合,电荷发生中和,阻碍pDNA向电解池阳极移动,根据阻碍程度,可以判断出电荷中和程度,间接反映出载体对pDNA的复合能力。载体对pDNA的有效复合将有利于pDNA在基因转染过程中的稳定运载,同时保护pDNA免受核酸酶的降解,从而提高基因转染效率。由图9复合物与裸pDNA的电泳条带长度可以看出,当载体与pDNA质量的比值大于0.4时,两者复合可有效形成复合物,Im-PEI载体有利于pDNA免受降解而稳定运载,载体与pDNA的复合能力随载体与pDNA比例的增大而略有增强。图10为MTT法评价合成的Im-PEI载体的细胞毒性结果图。结果表明,Im-PEI载体生物相容性良好,载体与pDNA质量比为2∶1和4∶1的复合物细胞存活率要高于纯PEI载体/pDNA复合物,接近90%,载体与pDNA质量比为6∶1和8∶1时细胞存活率有所降低,但也都在70%以上。图11为荧光素酶报告基因评价载体的转染效率结果图,Im-PEI载体能够有效地转染细胞。但与作为对照的PEI相比,Im-PEI载体的转染效率稍低,其中载体与pDNA的比值为8∶1时的转染效率最高(如图11所示)。综合考虑上文的生物相容性检测结果,以及为使载体能够高效地与锌离子作用从而被凝胶吸附需要咪唑有较高含量,载体与pD-NA之比为8∶1时是最为合适的选择。通过荧光显微镜观察在浓度为0.5mmol/L锌离子的浸泡下,水凝胶吸附Im-PEI载体与绿色荧光标记的pDNA复合物的情况,如图12所示。没有锌离子存在的情况下,水凝胶与载体/pDNA复合物之间没有比较强的化学键或作用力,复合物难以在水凝胶表面附着,即使暂时停留在水凝胶表面也很容易脱落,因此,由图12(a)可见,复合物在水凝胶表面的吸附量很少。而同时加入锌离子与复合物,使锌离子与水凝胶或复合物上的咪唑环发生络合作用,且锌离子和两者络合的机会接近均等,络合键同时联结水凝胶与复合物的几率很大,也就使水凝胶能吸附大量的载体/pDNA复合物,所以通过荧光显微镜能够观察到很多绿色光点,在图12(b)中的黑白图中表现为白色亮点。这一结果表明,本文制备的这种水凝胶有作为基因转染固态材料应用的潜力。

3结论

本文制备了Im-PAA-HEAA大分子单体,并通过光引发制成了该大分子单体质量分数为10%、15%和20%的锌离子响应水凝胶。单体含量的增加可以使凝胶中交联网络密度增大,网络结构更趋稳定,因此水凝胶的强度会随着大分子单体浓度的增加而增加。水凝胶经过低浓度的锌离子浸泡处理后,由于锌离子与咪唑基团的作用,水凝胶体积收缩、吸水率降低、力学性能增强,其中单体质量分数为10%的水凝胶收缩率最高,单体质量分数为20%的水凝胶力学性能最强。Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶具有良好的生物相容性,细胞能够在凝胶表面生长。制备的基于Im-PEI的非病毒载体,可以有效地复合pDNA,兼具低毒和高转染效率。Im-PAA-HEAA/PEGDA水凝胶在锌离子作用下,能够吸附大量的Im-PEI/pDNA复合物,有望作为反向基因转染的载体。

[参考文献](References)

[1]SUNLiang,ZHANGSijie,ZHANGJinlong,etal.Fentonreaction-initiatedformationofbiocompatiblein-jectablehydrogelsforcellencapsulation[J].JournalofMaterialsChemistryB,2013,1(32):3932-3939.

[2]HOFFMANAS.Hydrogelsforbiomedicalapplications[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2002,54(1):3-12.

[3]ZHANGJinlong,WANGNing,LIUWenguang,etal.Intermolecularhydrogenbondingstrategytofabricatemechanicallystronghydrogelswithhighelasticityandfatigueresistance[J].SoftMatter,2013,9(27):6331-6337.

[4]NANWenjing,WANGWei,GAOHan,etal.Fabri-cationofashapememoryhydrogelbasedonimidazole-zincioncoordinationforpotentialcell-encapsulatingtu-bularscaffoldapplication[J].SoftMatter,2013,9(1):132-137.

[5]MINTZERMA,SIMANEKEE.Nonviralvectorsforgenedelivery[J].ChemicalReviews,2008,109(2):259-302.

[6]SHENHong,TANJian,SALTZMANWM.Surface-mediatedgenetransferfromnanocompositesofcon-trolledtexture[J].NatureMaterials,2004,3(8):569-574.

[7]REAJC,GIBLYRF,DAVISNE,etal.Engineeringsurfacesforsubstrate-mediatedgenedeliveryusingre-combinantproteins[J].Biomacromolecules,2009,10(10):2779-2786.

[8]SEGURAT,CHUNGPH,SHEALD.DNAdeliveryfromhyaluronicacid-collagenhydrogelsviaasubstrate-mediatedapproach[J].Biomaterials,2005,26(13):1575-1584.

[9]desRIEUXA,SHIKANOVA,SHEALD.Fibrinhy-drogelsfornon-viralvectordeliveryinvitro[J].Jour-nalofControlledRelease,2009,136(2):148-154.

[10]顾雪梅,安燕,殷雅婷,等.水凝胶的制备及应用研究[J].广州化工,2012,40(10):11-13.GUXuemei,ANYan,YINYating,etal.Preparationandapplicationofhydrogels[J].GuangzhouChemicalIndustryandTechnology,2012,40(10):11-13.(inChinese)

[11]BOUSSIFO,LEZOUALC’HF,ZANTAMA,etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo:polyethylenimine[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1995,92(16):7297-7301.

[12]DAIZhuojun,GJETTINGT,MATTEBJERGMA,etal.ElucidatingtheinterplaybetweenDNA-condensingandfreepolycationsingenetransfectionthroughamechanisticstudyoflinearandbranchedPEI[J].Bio-materials,2011,32(33):8626-8634.

作者:宋俊飞 石成望 王玮 单位:天津大学材料科学与工程学院

中国科技论文杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次