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乳酸菌在疫苗递呈载体中的应用

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《药物生物技术杂志》2014年第二期

1载体

1.1质粒型克隆载体目前,在乳酸乳球菌基因操作中应用最为普遍的是诱导型克隆载体,其可控性强,表达量高。采用诱导型启动子已实现了许多外源蛋白在乳酸乳球菌的大量表达,并开发出含有不同诱导型启动子的多种表达系统,如T7启动子的表达系统、乳糖诱导转录系统、温度诱导系统、噬菌体感染系统和NICE系统等,其中后二者诱导效率可达1000倍以上[4]。此外,人们也开发了一些受环境条件调控的诱导型启动子。P170由orfX基因编码,是一个强启动子。相比NICE系统,它的优点在于生长中可以通过乳酸的积累自我诱导,但其依存的pH值范围较狭窄,而且受培养温度的影响较大。近来,还有一些新的乳酸乳球菌表达系统出现如木糖诱导系统及zn缺乏诱导系统。同时,许多组成型的启动子也相继被发现。Vander等用P21、P23、P32、P44和P59等5种启动子表达氯霉素乙酰基转移酶,通过其活性水平来确定启动子的强弱,结果显示,在上述的5种启动子中,P21,P23和P59属于强启动子,P32和P44属于弱启动子[5]。另外还有P[6]1、PLPS2、Pnuc、PamyA、Pldh、PslpA等[7]启动子被用来实现外源抗原基因的表达。

1.2整合型克隆载体除了用质粒表达外源蛋白外,乳酸乳球菌染色体整合型的表达系统也有很多成功的例子。将携带人IL-10基因及胸腺嘧啶合成酶(thyA)基因序列的质粒载体转入L.lactisMG1316中,通过同源重组,IL-10基因可取代染色体上的thyA基因,IL-10可以稳定表达[8]。Mohammed等[9]利用胞嘧啶合成酶基因(△pyrG)作为标记,将携带单核细胞增生李斯特菌产生的溶血素(LLO)基因的质粒(pORIP23:SEC-LLO)导入L.lactisGM1316,染色体与质粒通过两次同源重组,实现了LLO的组成型分泌表达。

2异源蛋白在乳酸乳球菌中的靶向表达

为了使乳酸乳球菌成为生产蛋白的细胞工厂,必须改造受体菌株和有效的表达载体系统,可是,要使这些蛋白获得相应的生物活性,有必要使他们锚定在特定的细胞位置。已有简单有效的表达锚定系统开发出来,采用组成型启动子P59、SPUSP45和酿脓链球菌M6蛋白(CWAM6)的锚定序列可使得葡萄球菌核酸酶NucA分别锚定在细胞质,细胞外基质和细胞壁上,但是蛋白表达量较低。SPUSP45是目前发现的在乳酸乳球菌中分泌效率最高的信号肽。目前表达可控性强,应用较为广泛的还是nisin控制的NICE表达系统,Belkis等[10]在质粒pNZ8048基础上,将轮状病毒突起蛋白VP8的基因单独或分别与USP45及CWAM6组合构建到nisA启动子的下游,可分别实现了VP8在L.lactisNZ9000中的胞内、分泌及细胞壁锚定表达,胞内表达量为0.3mg/L,分泌蛋白量达0.6mg/L,分泌效率达65%。细胞壁锚定表达量达0.5mg/L,50%的蛋白都锚定在细胞壁(图1)。

3乳酸乳球菌作为疫苗载体的应用

近20年来,利用乳酸乳球菌作为抗原载体的研究十分广泛,可表达病毒、细菌、寄生虫及哺乳动物等各种抗原,可以预防或治疗感染性疾病、癌症及自身免疫性疾病。

3.1抗微生物感染红球菌属会导致严重的肺炎,尤其在免疫力低下的人中比较常见,目前还没有有效的疫苗可利用,Cauchard等[11]将来源于红球菌属的分泌素相关的蛋白A的基因构建到乳酸乳球菌(LL-VapA)中,单独或联合能分泌瘦素的乳酸乳球菌LL-Lep经口免疫小鼠,结果显示,共免疫LL-VapA和LL-Lep组,脾细胞经刺激产生的IFN-γ和IL-4的水平相对于单独免疫LL-VapA组都显著增高,对致病菌攻击产生的保护效果是单独免疫LL-VapA组的3~4倍。Lei等[12]将禽流感病毒H5N1的血凝素HA1抗原展示在乳酸乳球菌的表面,联合很强的粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位(CTB),经口免疫BALB/c雌性小鼠,结果显示重组HA1的乳酸乳球菌联合佐剂CTB共免疫组产生了高滴度的IgG和IgA抗体,并且对H5N1攻击获得了100%的保护,其它组的小鼠10d内就都死亡了。此外,近几年来还有很多探索抗其它病原菌和病毒感染的重组乳酸乳球菌疫苗(表1)。Hugentobler等[13]将利什曼原虫保守抗原LACK以胞内、分泌及细胞表面3种表达形式在乳酸乳球菌PH3960(丙氨酸消旋酶突变菌株(alr-))中成功表达,并分别与分泌型的IL-12实现共表达。他们考察了以上3株共表达乳球菌与共免疫乳球菌(分泌表达LACK的乳球菌和分泌表达IL-12乳球菌)对小鼠抗病原体的效果,结果显示只有LACK与IL-12共表达的乳酸乳球菌激发的粘膜反应与系统性免疫反应最强,也只有该组能对利什曼原虫攻击显示出保护效果,这种保护效果主要是因为该菌株可以引发抗原特异性的Th1型反应。

3.2抗肿瘤宫颈癌已成为继乳腺癌之后引起女性死亡的第二大癌症,人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌的主要致病因子之一。Perez等[24]将Mig:IP-10细胞因子与16型人乳头状瘤病毒E7抗原在乳球菌NZ9000中共表达,免疫动物后,共表达组(LL-Mig:IP-10/E7)激发的血清IgG和粘膜IgA的水平都比单独表达E7组(LL-E7)更高,尤其是粘膜IgA二者之间有显著性差异。Ribelles等[25]以来自干酪乳杆菌的A2噬菌体溶解素(LysA2)的细胞绑定结构域(CBD)将E7抗原以非共价的形式锚定在乳酸乳球菌的表面,接种了该菌的小鼠激发了很强的抗原特异性的CTL反应,显著的抑制了肿瘤的生长。如能将HPV11、16、18等几种高感染率的抗原在乳酸乳球菌共表达,制备成多价疫苗更是有着特别诱人的前景。

3.3抗自身免疫性疾病过敏性疾病,是人体受抗原物质刺激后引起组织损伤或生理功能紊乱的一种异常的免疫反应,通常为免疫反应异常增高。牛奶过敏症在婴幼儿当中很常见,80%~90%的患者可通过长期喝牛奶达到耐受[26]。β-乳球蛋白(BLG)是牛奶中的主要的变应原,Cortes-Perez等[27]将LL-BLG经鼻免疫Balb/c小鼠,结果显示小鼠血清和支气管粘膜部的IgG1的水平都有减低,小鼠下调了对参与过敏反应的Th2应答。该课题组还将重组乳酸乳球菌LL-BLG与LL-IL12经鼻共免疫BALB/c小鼠,产生了BLG特异性的Th1型反应,获得了对BLG的完全耐受[28]。IL-10是公认的一种内源性抗炎细胞因子,是治疗炎症性疾病的很好的侯选者,如在治疗克罗恩氏病(CD)、溃肠性结肠炎(UC)中,已证明是非常有效的,然而注射后在体内全身分布会引起一系列的副作用,而且对酸特别敏感,利用乳酸菌作为其递呈载体可以直接供给病变部位,目前,用分泌IL-10的重组乳酸乳球菌(LL-IL10)治疗炎症性肠疾病已进入临床试验阶段。临床Ⅰ期结果显示,在克罗恩病人中重组乳酸乳球菌(LL-Thy12-IL10)有很好的耐受和安全性,目前正在进行Ⅱ期临床以期治疗溃疡性结肠炎,改用重组乳球菌(sAGX0037),同样分泌IL-10,但改用启动子PhIIA,其表达IL-10的量为一期临床所用的菌株(Thy12启动子)的4倍[8]。另外,Paul等[29]以分泌表达人弹力素的乳酸乳球菌经口免疫DSS诱导的小鼠肠炎模型,结果显示,减弱了肠部促弹性组织离解活性(Elastolyticactivity)和炎症,其也有治疗人炎症性肠疾病潜力。I型糖尿病(TypeIdiabetes),是一种以自身反应性T细胞(AutoreactiveTcell)对胰岛β细胞进行性破坏为主要特征的自身免疫性疾病。胰岛素和胰岛素原是T1D的重要抗原,胰岛素自身抗体在高风险病人体中广泛存在。人体实验显示,经口腔、鼻腔给药胰岛素都没能阻止高风险人群患糖尿病、或减缓最新诊断获得T1D的患者的病情发展[30]。而利用乳酸菌作为口服递呈胰岛素或胰岛素原的载体是一种很好的策略,可以减少胰岛素在胃肠道里的降解,从而提高抗原的生物利用率。Takiishi等[31]将重组前胰岛素原和IL-10的乳球菌以及低剂量的抗CD3单克隆抗体联合治疗新诊断发病的NOD小鼠取得了很好的效果,仅仅连续给药6w,每周5次,到给药开始后的第14w就有59%的小鼠被治愈,并且恢复了正常血糖水平的小鼠,血糖以后也没有再波动。同样我们也可以考查利用乳球菌递呈其他与IDDM相关的自身抗原,如GAD65,热休克蛋白等。Liang课题组前期研究表明,HSP65-6P277重组蛋白通过鼻粘膜免疫的方式,诱导了NOD小鼠抗炎免疫应答并有很好的预防IDDM的发生,降低IDDM发病率[32],但该蛋白自身不稳定,易发生降解,分离纯化条件苛刻。马艳军等将该重组蛋白通过乳酸乳球菌来递呈到NOD小鼠肠粘膜,结果显示,重组乳酸乳球菌疫苗可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发并率和胰岛炎级别。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)虽然是由多种因素促成的一个复杂的病理事件,但是近10几年来研究发现AS与感染、炎症和自身免疫密切相关。侯景等成功构建了诱导表达和组成分泌表达HSP65的乳球菌NZ9000,利用高脂喂养的LDL-RD小鼠动物模型来考察HSP65乳酸菌粘膜疫苗免疫取得了很好的预防动脉粥样硬化AS的效果[33]。Rezende等[34]将木糖诱导分泌表达HSP65的质粒载体pXylT:SEC:HSP65导入乳球菌L.lactisNCDO2118中,经口腔连续5d免疫C57BL/6J后,于10d后诱导脑脊髓炎,结果显示,免疫LL-HSP65小鼠阻止了脑脊髓炎的发展。

4疫苗研制中需解决的问题或遇到的困难

人们已经探索了各种方法以使重组乳酸乳球菌免疫效果达到更好,如通过使用有效佐剂,或将抗原表达在细胞表面,克服其免疫原性相对较差的缺点,普遍认为细胞表面锚定的抗原免疫效果最好[6],但对于一些稳定性差的蛋白胞内表达可能是更好的。另外,在工业生产中,虽然采用诱导表达蛋白表达量高,但使用诱导剂也会增加成本,而组成型表达可避免添加诱导剂,且给药后在人的胃肠道仍能继续表达目的蛋白,但目前发现的组成表达的启动子都效率较低,因此找到高效率的启动子对于疫苗的开发是十分必要的。除此之外,以何种方式给药也会影响乳酸乳球菌疫苗的免疫效果。在Cauchard等[11]所做的研究也验证了这一点,与LL-Lep联合给药,两种给药途径没有差异,但单独经鼻粘膜给药LL-VapA要比胃肠道给药效果更好。鼻内免疫的小鼠显示,鼻内免疫相对于单独的胃肠道免疫可以引起更高的系统性的免疫反应,单独免疫LL-VapA就能引发IFN-γ反应。然而,Pei等[35]将分泌表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(SARS-CoVN)的乳酸乳球菌,经口服和鼻腔免疫小鼠,结果显示,经口服接种诱导的N蛋白特异性血清IgG应答水平更高。因此不同抗原需要采用何种免疫途径还需进一步探索。乳酸乳球菌是安全的,但现研究的表达系统中的多为质粒载体,且大多具有抗生素筛选标记,这些抗生素标记有可能转移到环境病原菌而带来危害,通过使用非抗生素选择性标记可以避免此类危险,但相对于益生菌食品仍有外源质粒,质粒上的外源基因仍有平行转移到环境中其他的微生物的可能[36],如将其作为功能性食品开发,需要转基因食品的安全性评价。若作为疫苗开发,同样安全性要求如何?归为几类药?这些问题尚未有明确的答案。

5结语

乳酸乳球菌是一种很有潜力的疫苗载体,其疫苗的生产避免了传统疫苗生产过程中复杂的分离纯化过程,大大降低了生产成本。尤其对于一些难以表达的蛋白或者在分离纯化过程中易降解的蛋白(如温度敏感蛋白等),这种用活菌表达蛋白直接给药的方式更是非常合适。乳酸乳球菌作为乳制品发酵剂的主要成分,其工业化生产也不是障碍,当疫苗在产业化程度较低的国家中使用时,这个优点特别有意义。但目前乳酸乳球菌载体疫苗还仅限于临床前研究阶段,乳酸乳球菌特性、免疫应答等基本理论还需要进一步探索。LL-IL10顺利进入二期临床为以后利用乳酸乳球菌作为活载体疫苗进入临床开辟了道路。希望在不久的将来,可以研制出针对不同病原体的安全有效的乳酸乳球菌载体疫苗。

作者:刘晓锐张晓红吴洁单位:中国药科大学生命科学与技术学院微基因药学实验室 南京医科大学南京市妇幼保健院生殖医学国家重点实验室

药物生物技术杂志责任编辑:田老师    阅读:人次
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