茶树菇活性蛋白组分的研究范文

《现代食品科技杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1Yt瘤内注射对H22荷瘤小鼠的抑制肿瘤生长实验BALB/c小鼠（雌雄各半，6周龄，16~18g）购自湖北省动物中心，并按照实验动物管理条例饲养在湖北省动物中心屏障系统中。由腹水小鼠抽取H22腹水，用生理盐水洗涤并重悬计数，以浓度为5×105个/mL皮下接种100μL于小鼠右前腿腋下，6~7d皮下有可触肿瘤块的形成说明模型构建成功。肿瘤细胞接种第四天，药物Yt按照5mg/kg动物体重的剂量通过瘤内注射使用，隔天注射16次，并记录肿瘤生长情况，测量肿瘤最大直径和最小直径，按照肿瘤体积=1/2L1L22（L1为最大直径，L2为最小直径）来计算。

1.2瘤内注射Yt产生抗体检测2.5mg/kg动物体重剂量的Yp和Ys按照Yt的注射方法进行，在BALB/c小鼠完成瘤内注射Yt、Yp、Ys治疗后，眼球采血，室温放置1h，置于4℃过夜。4000r/min离心10min，取上清用ELISA方法检测Yt、Yp、Ys抗体的产生。分别将20μg/mLYt、Yp、Ys包被在ELISA板上，4℃放置过夜。甩掉上清，室温下PBST（0.05%吐温）洗板5次，每次4min。3%BSA（溶于PBST）每孔200μL37℃封闭1h。室温下PBST（0.05%吐温）洗板5次，每次4min。加入检测血清。阴性对照包括：底物+终止剂；包被Yt、Yp、Ys+二抗+底物+终止剂；包被Yt、Yp、Ys+底物+终止剂。阳性对照为：20μg/mLYt包被+倍比稀释的AAL（Agrocybeaegeritalectin）-抗体（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000），实验组：倍比稀释的Yt治疗组动物血清（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000），倍比稀释的Yp，Ys治疗组动物血清（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000）。去除一抗，室温下PBST（0.05%吐温）洗板5次，每次4min。二抗1:4000037℃温浴1h。室温下PBST（0.05%吐温）洗板5次，每次4min。TMB显色5~20min，0.5mol/L硫酸终止反应。使用酶标仪测定450nm处OD值。

1.3Yt瘤内注射对荷H22的BALB/c小鼠的免疫记忆功能选择Yt治疗后肿瘤消退的小鼠，使用周龄相同的正常小鼠作为对照，两周后原位再次接种H22（1×106个/mL），观察小鼠肿瘤生长状况。

1.4小鼠血清细胞因子的表达水平检测瘤内注射Yt（5mg/kg）的BALB/c小鼠，在注射完成后，眼球采血，室温放置1h，置于4℃过夜。4000r/min离心10min，取上清用博士德IL-2，TNF-αELISA检测试剂盒检测血清中细胞因子IL-2，TNF-α的含量，使用IL-2，TNF-α的标准品倍比稀释作出标准曲线。1.6统计学方法应用统计软件SigmaStat3.5版本进行数据分析，首先进行标准化分析并转化以符合正态分布要求。肿瘤组织大小比较通过one-wayANOVA结合Tukeyposthoctests分析。数据均使用平均值±SD表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果与讨论

2.1Yt在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤活性在之前研究中，我们发现从茶树菇中提取的活性蛋白组分Yt，无论是在肿瘤细胞系还是荷瘤小鼠模型上，都表现出显著的抗肿瘤活性，且其抗肿瘤活性与免疫系统密切相关（裸鼠模型中抗肿瘤活性部分丧失）[5]。因此希望通过进一步研究，探讨活性蛋白组分Yt对荷瘤小鼠的免疫调节功能。肿瘤大小统计数据显示（图1），实验组与对照组小鼠肿瘤大小显著不同，小鼠肿瘤组织的生长得到明显抑制，尤其是在第27、29、31、33、35、37d，10只小鼠接种位置肿瘤组织完全消退。上述数据说明Yt在荷H22的小鼠模型中表现出显著的抑制肿瘤活性，这与之前的研究结果是一致的。而Yt的分离组分蛋白质Yp和小分子组分Ys，二者仍具显著的抗肿瘤活性，但都弱于总组分Yt[6]，这说明Yt的抗肿瘤活性是通过两种组分作用的累加。

2.2荷瘤小鼠瘤内注射Yt产生抗体检测由于Yt组分主要是蛋白质Yp和小分子化合物Ys[6]，蛋白质组分可能会使机体产生大量抗体从而具有毒性，因此我们使用ELISA方法检测Yt治疗小鼠（5mg/kg）血清抗体产生情况及蛋白质组分Yp、小分子组分Ys（2.5mg/kg）治疗小鼠后血清抗体产生情况，结果见表1。以AAL（Yt的主要成分之一）的抗体为阳性对照，结果表明，当AAL抗体在低浓度下（1:64000），仍然可以检测到阳性信号。Yt治疗组动物血清在高浓度下（1:500），信号依然很弱。其中小分子组分Ys治疗组小鼠血清在高浓度（1:500）下，阳性信号很弱，这与小分子物质不易引发动物机体免疫反应有关，而蛋白组分Yp引发机体抗体血清滴度很低，这可能与蛋白组分含量较高，高频注射产生高区带耐受有关。也说明了Yt、Yp、Ys瘤内注射不会因引发机体产生大量抗体而带来毒性。蛋白质/多肽由于其容易在胃肠道及血液中被降解，或者容易产生抗体，在传统观点中通常不作为药物开发的候选分子，这也是药用真菌中蛋白质活性成分被忽略的重要原因之一。然而，近些年来，越来越多的蛋白/多肽被开发成药物，蛋白/多肽药物也因其高亲和性，高特异性，低毒性的特点，逐渐成为现代医药的重要组成部分。例如，豚鼠血清来源的L-天冬酰胺酶，由于肿瘤细胞的生长比正常细胞需要更大量的天冬酰胺，因此使用天冬酰胺酶降解天冬酰胺，从而特异性抑制肿瘤细胞的生长，L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病的常用药物[7]。2005年通过批准的艾塞那肽Exenatide是从大毒蜥唾液中提取的一种多肽类药物，用于治疗II型糖尿病[8]。虽然有许多蛋白/多肽从真菌中分离纯化出来，但报道具有活性的仍是少数。我们研究发现，药用真菌中蛋白/多肽组分具有很强的抗肿瘤和延长小鼠生存期的活性，且毒性较小，表明其作为抗肿瘤候选药物的潜力。

2.3Yt抗肿瘤效应的免疫记忆作用Yt在BALB/c小鼠及裸鼠模型中表现出不同的抗肿瘤活性，且通过刺激小鼠的免疫系统来发挥活性[5]。我们进一步检测这种免疫活性是否具有记忆性。瘤内注射Yt（5mg/kg）16次，选择肿瘤消退的小鼠，两周后原位再次接种H22（1×106个/mL，为建肿瘤模型的10倍），同时使用相同周龄的小鼠做对照。从表2可以看出，对照组小鼠肿瘤正常生长，Yt治疗且肿瘤消退的小鼠再次接种H22肿瘤细胞，到第三周都未见肿瘤生长。这说明Yt处理后小鼠的免疫反应具有记忆性，可保护小鼠不长肿瘤。肿瘤治疗的临床难题之一即手术后的复发转移，因此好的治疗型肿瘤疫苗除了可消退肿瘤或抑制肿瘤转移，更重要的是具有预防保护作用[9]。很多临床试验研究发现，单独使用肿瘤细胞的免疫源性会比较弱，因为很多肿瘤抗原是机体耐受的。在20世纪70年代，人们发现注射活的BacilleCalmette-Guerin（BCG）可以使转移性黑素瘤病人肿瘤缩小，从而推测非特异性的免疫激活可以帮助刺激肿瘤特异性免疫反应[10]。因此近年来，多使用佐剂包括BCG，CorynebacteriumParvum，DETOX，铝盐来提高疫苗免疫激活的作用。国内研究者也有使用天然提取物作为佐剂[11]。Yt治疗的小鼠可获得免疫记忆能力，暗示了茶树菇活性蛋白组分作为肿瘤疫苗佐剂的潜力。

2.4瘤内注射Yt对荷瘤小鼠血清细胞因子蛋白表达水平的影响细胞因子的表达与免疫调节及维持免疫记忆的能力有密切关系[12]，因此使用ELISA检测荷H22小鼠瘤内注射vehicle和Yt（5mg/kg）后，血清中IL-2和TNF-α的蛋白表达水平。如图2所示，血清中IL-2表达水平在对照组小鼠中为38.9±27.59pg/mL，Yt治疗组为84.6±37.6pg/mL，提高到对照组的2.17倍（p<0.05）。而TNF-α在对照组和治疗组分别为188.4±91.3和200.3±52.2pg/mL，没有显著性差异（p>0.05）。大型真菌中提取的活性组分大多以免疫调节为作用方式，通过调节细胞因子的分泌来增强天然免疫系统和细胞免疫反应。例如，从Volvariellavolcacea分离的蛋白Fip-wo可上调小鼠IL-2、IL-4、IFN-γTNA-α的mRNA表达水平[13]。从Grifolafrondosa分离的低分子量蛋白组分MLP可诱导结肠癌小鼠脾脏IL-12和IFN-γ的表达[14]。之前的研究表明，瘤内注射Yt可上调Th1型细胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α），下调Th-2型细胞因子（TGF-β）mRNA的表达[5]。蛋白组分Yp可上调Th2型细胞因子IL-10的mRNA表达，与Fip[13]、MLP[14]不同[6]；小分子量Ys可上调GM-CSF和TGF-β的mRNA表达[6]。本文发现Yt可上调血清IL-2的表达，与之前的Yt诱导脾脏IL-2的mRNA表达数据一致。Yp和Ys分别通过调节不同的细胞因子产生来发挥抗肿瘤活性，主要由Yp和Ys组成的Yt则通过同时调节Th1型和Th型免疫应答来发挥功能。另外，有报道表明细胞因子IL-2、GM-CSF可以提高肿瘤疫苗的抑制肿瘤活性及免疫保护活性[15]，瘤内注射Yt显著抑制肿瘤生长的活性及免疫记忆功能有可能与其上调细胞因子IL-2有关。

3结论

基于对Yt抗肿瘤活性的研究，说明大型真菌活性蛋白质组分是除多糖之外另一重要活性成分，值得深入研究。本文检测了Yt治疗荷瘤小鼠后，并不诱导机体产生大量抗体；且可诱导机体产生抗肿瘤免疫记忆功能，保护小鼠再次接种肿瘤细胞时不长肿瘤；另外Yt注射可上调小鼠血清细胞因子IL-2的表达。该数据表明，Yt通过调节机体免疫系统功能，发挥其显著的抗肿瘤活性。进一步分离鉴定Yt中的有效组分，将有助于阐明Yt免疫调节功能，并为大型真菌有效活性组分及应用提供理论数据。

作者：梁一郭莲仙孙慧单位：广东医学院医学检验学院武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室