酵母细胞表面展示载体的构建范文

《生物技术杂志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验材料酿酒酵母Y187(Matα，trp1－901，leu2－3，112，ura3－52，his3－200)，DH5α(supE44，Δlac，U169，hsdR17，recA1，en-dA1，gyrA96，thi21，relA1)，pPIC9K和pADH1均为作者实验室保存。

1.1.2试剂SacⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ等限制酶，T4DNA连接酶和PCR产物纯化试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。

1.1.3培养基LB培养基:1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%氯化钠，pH7.0。YPDA培养基:1%酵母提取物，2%多价蛋白胨，2%葡萄糖，0.003%腺嘌呤，pH6.5。YPD培养基:1%酵母提取物，2%多价蛋白胨，2%葡萄糖，pH6.5。1.2方法

1.2.1相关基因的克隆和序列分析以质粒pPIC9K为模板，以F(s):5’－CGGGAGCTCAT-GAGATTTCCTTCAATTTTTACT－3’和R(s):5’－GGCATCGATCGGATCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCT－3’为引物扩增信号肽编码序列。以酿酒酵母基因组为模板，以F(agg):5’－GGGGAATTCTCTAGAGGTGGTGGTGGTTCTCAT-CATCATCATCATCATAGCGCCAAAAGCTCTTTTAT－3’和R(agg):5’－GGGGCATATGTTTGATTATGTTCTTTCTATTTGAAT－3’为引物扩增锚定序列。上游引物F(agg)中下划线碱基序列依次是编码EcoRⅠ和XbaⅠ识别序列，黑体部分是引入的Gly4Ser连接肽和6×HisTag，连接肽的引入以减少蛋白折叠的空间位阻效应，His标签的引入为展示蛋白(用抗His标签抗体检测)的检测和纯化(亲和层析柱)提供了方便;下游引物中下划线部分编码NcoⅠ的识别序列。以pEGFP－C1为模板，以F(gfp):5’－TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG-GAGC－3’和以R(egfp):5’－GCTCTAGACTTGTA-CAGCTCGTCCATGCCGA－3’为引物扩增EGFP编码序列，引物中下划线分别编码XbaⅠ和SmaⅠ位点。信号肽，凝集素和绿色荧光蛋白的编码序列的PCR扩增条件为:94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸1～3min，72℃延伸7min，共30个循环。序列分析由上海生物工程公司完成。

1.2.2表面展示载体的构建及其验证用SacⅠ和ClaⅠ双酶切信号肽编码序列和载体pADH1，通过T4连接酶将信号肽编码序列插入载体pADH1以构建酵母分泌型表达载体pADH1－signal。用F(s)和R(s)引物对重组载体进行PCR验证，用SacⅠ和ClaⅠ对重组载体进行双酶切验证。用EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切载体pADH1－signal和锚定序列，通过T4连接酶将锚定序列插入到分泌型载体pADH1－signal中，构建展示表达载体pADH1－agg。用F(agg)和R(agg)引物对展示表达载体进行PCR验证，用EcoRⅠ和SmaⅠ对展示表达载体进行双酶切验证。相关的酶切，连接和转化等分子生物学操作采用分子克隆手册方法，具体参见“Sam-brook＆Russell，2001”。

1.2.3酵母表面展示载体的功能验证———EGFP展示用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切EGFP和载体pADH1－agg，通过T4连接酶将EGFP编码序列插入到载体pADH1－agg中，构建展示表达载体pADH1－EGFP。以F(egfp)和R(egfp)为引物进行PCR鉴定，用HindⅢ对pADH1－EGFP和pADH1进行酶切鉴定。分别将含有pADH1－EGFP和pADH1－AGG的酵母在YPDA培养基培养72h(30℃、200r/min)。5000r/min离心5min收集菌体，并用无菌水洗涤菌体2次;用无菌水稀释菌体并分别荧光显微镜的可见和蓝光下观察菌体(10×100倍)。

2结果与分析

2.1相关基因的克隆及序列分析用方法

2.2.1扩增相关的序列，所得到的PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。由图2中可以看出，得到了267bp的信号肽序列、1623bp的凝集素编码序列和717bp的绿色荧光蛋白编码序列。DNA序列的测序结果显示:信号肽编码序列和GenBank上gi309774076的序列一致，锚定序列与GenBank上gi171041序列一致。EGFP的编码序列与GenBank上JQ064509.1的序列一致。

2.2表面展示载体的构建

2.2.1酵母分泌型表达载体的构建及验证用方法

2.2.2构建酵母分泌表达载体并验证，其结果见图3。用引物F(s)和R(s)从重组载体中扩增出与预期大小一致的267bp的片段。用SacⅠ和ClaⅠ双酶切载体pADH1－signal和pADH1的结果显示:酶切pADH1－signal得到约267bp和7200bp的片段，其中，267bp的片段与信号肽编码序列大小一致，表明信号肽基因已成功插入到pADH1载体中，pADH1－signal构建成功。

2.2.2酵母展示载体的构建和验证用方法

1.2.2构建酵母表面展示载体并验证，结果见图4。用引物F(agg)和R(agg)从重组载体中扩增出与预期大小一致的1623bp的片段，用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切pADH1－agg得到约1645bp和7200bp的酶切片段，其中1645bp的片段大小与锚定序列大小一致，而酶切pADH1－signal后没有得到1645bp大小的片段，表明锚定序列已成功插入到pADH1－signal载体中，pADH1－agg构建成功。

2.2.3酵母表面展示载体的功能验证———EGFP展示通过方法

2.2.3将EGFP编码序列插入pADH1－agg并对重组载体进行PCR和双酶切验证。结果见图5。用引物F(egfp)和R(egfp)从重组载体中扩增出与预期大小一致的717bp的片段。用HindⅢ酶切载体pADH1－egfp可得到大小约2650bp和7200bp的酶切片段，其中2650bp的片段包括267bp的信号肽，1623bp的锚定序列和717bp的EGFP序列，序列总长度与预期一致。而HindⅢ酶切pADH1－agg后不能得到2650bp的片段，表明EGFP序列已插入pADH1－agg中，pADH1－EGFP构建成功。通过方法

2.2.3用荧光显微镜观察菌体细胞，其结果如图6所示，从图6可以看出:含pADH1－GFP的酵母菌在可见光下无荧光，但在蓝光下有绿色荧光，而阴性对照菌株pADH1－AGG在可见光和蓝光下均无荧光。这表明EGFP在酵母中成功地得到了表达。

作者：张秀艳侯晓彦陈福生王小红单位：华中农业大学食品科技学院