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转录调控蛋白基因的克隆

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《生物技术通报杂志》2014年第七期

1材料与方法

1.1材料

嗜水气单胞菌Zf1菌株由本实验室保藏。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司,pMD18-TVector购自TaKaRa公司,UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR扩增试剂均购自上海捷瑞生物工程公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成参考嗜水气单胞菌AhyR基因序列(登录号:YP_855090),设计特异性上下游引物(AhyR-F:CGATTGCGAAAGCGATAA;AhyR-R:CTGCTGAGCCATTGGTTTT)用于PCR扩增Zf1菌株AhyR基因,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2Zf1菌株AhyR基因克隆参考李雪等[10]方法,将Zf1菌株接种于LB液体培养基中,28℃培养12h。取1mL菌液用于提取基因组DNA,具体操作参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。将提取到的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测,-20℃保存备用。PCR扩增采用10μL体系:提取的Zf1菌株基因组DNA模板1.0μL,上下游引物各0.5μL,MasterMix5.0μL,ddH2O3μL。PCR循环条件为:94℃预变性2min,94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸2min,经30个循环后72℃再延伸10min。得到目的条带后,按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因。将胶回收得到的DNA片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测,-20℃保存备用。将AhyR基因胶回收产物与pMD18-T载体连接,转化到DH5α感受态细胞,阳性克隆菌样送上海生工测序。

1.2.3基因序列及其结构分析用Editseq推测氨基酸序列,利用MotifScan、blastp程序预测结构域,NetPhos2.0Server预测磷酸化位点。通过邻接法(Neighbor-Joining),应用MEGA5.1软件构建系统发育进化树分析。将蛋白氨基酸序列提交SWISS-MODEL预测三级结构,用RasMolVersion2.7.5.2查看蛋白三级结构,并用拉马钱德兰图(Ramachandranplot)检测蛋白模型的合理性。

2结果

2.1Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析PCR扩增得到一条特异性条带(图1),测序获得AhyR基因大小为1063bp,引物序列见图2,推测ORF编码260aa;查找结构域发现AhyR蛋白18-168aa区域为自体诱导物结合域(PF03472),176-241aa区域为LuxR型螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域(PS50043),183-227aa区域为DNA结合域(PF04967)(图3);预测AhyR蛋白含有13个磷酸化位点,其中有8个丝氨酸(15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S)、3个苏氨酸(30T、184T、188T、)和2个酪氨酸(161Y、231Y),进一步预测酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(15S、173S、184T、199T)和蛋白激酶C磷酸化位点(173S、184T、210T、222T)(图4)。

2.2AhyR基因蛋白序列比对及系统进化树分析对AhyR蛋白进行多重序列比对表明气单胞属不同菌种AhyR氨基酸序列高度保守,与杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)、维隆气单胞菌(A.veronii)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、中间气单胞菌(A.media)、简达气单胞菌(A.jandaei)序列同源性分别为100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。构建系统发育进化树分析显示AhyR为LuxR同源蛋白之一,AhyR蛋白与嗜水气单胞菌(登录号YP_855090)的AhyR蛋白亲缘性最近,自然聚为一支(图5)。

2.3AhyR基因编码蛋白三级结构预测进一步分析AhyR蛋白三级结构,确定以群体感应控制阻遏物的A链(PDB:3SZT_A)为模板,该蛋白与模板相似性达28.40%,通过SWISS-MODEL在线比较建模结果,如图6-A所示,AhyR蛋白主要由15个α螺旋、5个β折叠和19个转角构成,该三级结构与二级结构序列特征分析结果基本一致;图6-B显示LuxR型螺旋-转角-螺旋结构域主要以α螺旋分布在三级结构C端外侧。拉马钱德兰图检测结果(图7)表明有93.9%氨基酸序列位于最适宜区,5.9%氨基酸序列位于允许区,证实AhyR基因推导蛋白的三级结构模型合理。3讨论嗜水气单胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等,还与转录调控蛋白AhyR基因有关[3]。AhyR蛋白在嗜水气单胞菌蛋白酶活性调节中起重要作用,促使胞外蛋白酶较早表达,有效防御病原菌侵入抵制感染[7]。Bi等利用自杀性重组质粒pJP-AhyR插入诱变嗜水气单胞菌J-1菌株AhyR基因,构建该基因突变株J-1△AhyR,证实AhyR基因。

作者:李雪  胡秀彩 兰云 沈晓静 吕爱军朱爱华单位:江苏师范大学生命科学学院

生物多样性杂志责任编辑:田老师    阅读:人次
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