家畜繁殖生物技术论述范文

随着相关领域的研究发展，生殖生物工程技术越来越多的应用到家畜，包括人工授精、胚胎移植、体外受精、动物性别控制、动物克隆、转基因动物、干细胞研究等组成的多元化的生殖生物工程技术，统称为繁育生物技术。

1人工授精和胚胎移植技术

自饲养家畜以来，人类一直在选用优良品质的雌雄个体进行家畜的改良。从20世纪六、七十年代以来，随着科学的发展和技术的开发，加快了家畜品种改良的进程，产生了极大的经济效益和社会效益，从根本上改变了人们对畜牧产业的认识。人工授精技术的推广应用使优良雄畜的繁殖效率提高千万倍［2］，到目前为止也是现代家畜育种改良技术的主要手段之一。但是，子代的遗传性能取决于父母双方，仅有好的父本不能得到理想的子代。因此在继人工授精技术推广应用后，研究者又着眼于优良母性遗传性能的研究开发，促使胚胎移植技术的产生和应用开发。用于移植的早期胚胎自身具有发育为生命个体的能力，这一点和用于人工授精的精液不同，后者必须与雌性生殖道内的卵子结合，即受精后才能向生命个体发育。因此，虽然胚胎移植和人工授精技术在操作方法上基本相同，但注入母体内的胚胎和精液在生殖生理意义上具有本质区别。胚胎移植技术的研究可上溯到19世纪末期。1890年，英国的生物学者Heape［3］首次把安哥拉兔的受精卵移入到另一种兔的输卵管，得到了2只小兔，20多年之后，Biedl等［4］同样用家兔重复了胚胎移植实验，得到了产仔结果。1934年，Pincua和Enzann使用家兔继续对胚胎移植进行研究，此后以实验动物(小鼠:mouse，大鼠:rat，地鼠:hamster)和家兔的胚胎移植研究开始活跃起来。同时期进行了绵羊的胚胎移植实验并首次在家畜上取得成功［2］。进入20世纪40年代，大量开展以中型家畜为对象的胚胎移植技术研究，如李喜和等［2］。1950年前后，大部分家畜胚胎移植取得成功，极大地推进了胚胎移植技术的实用化进程。内蒙古大学和内蒙古赛科星繁育生物技术有限公司(简称赛科星公司)选择西门塔尔黄牛为受体进行了荷斯坦高产奶牛性控胚胎的生产和移植，目的是在短时间内大规模的进行高产奶牛核心群的快速扩繁，繁育优良核心后备群。图1为荷斯坦高产奶牛性控胚胎体内生产过程及诞下的性控牛犊。胚胎移植结合性别控制技术在白绒山羊生产实践中具有广泛的现实意义，可以加速遗传育种进程，发挥优良公羊、母羊的繁殖优势。内蒙古大学和赛科星公司应用X性控冷冻精液生产性控胚胎，结合胚胎移植技术成功繁育我国首例胚胎移植的性控绒山羊(图2)，为促进白绒山羊育种提供了新的技术模型。

2体外受精技术

哺乳动物的受精是在雌性生殖道内进行的一个生理过程。把受精过程人为地在体外完成的技术称作体外受精(invitrofertilization，IVF)。哺乳动物体外受精的研究已有一百多年的历史。1878年德国学者Schenk首先用家兔和豚鼠卵子进行了体外受精试验，虽然他的实验结果并未得到受精的确凿证据，但从此揭开了体外受精技术研究的序幕［7］。进入20世纪，随着自然科学的发展和显微镜观察技术的进步，对生殖细胞的结构和生理有了许多新的认识和发现，推动了哺乳动物生殖生理学和其他生物技术的研究开发［8］。1951年，美国华裔生物学家张明觉［9］和澳大利亚Austin［10］分别使用家兔和大鼠，观察到了精子获能现象(capacitation)，他们提出精子只有在雌性生殖道内停留一段时间才具备穿入卵子而完成受精的能力。此后的大量研究结果表明，精子获能是哺乳动物受精过程中普遍存在的生殖生理现象，只有获能后的精子才可进行受精，上述两个观点打开了哺乳动物受精研究新纪元。家畜卵子的体外受精和胚胎移植是一项具有重要科学价值和应用前景的生殖生物工程新技术，1978年，外科医生Steptoe和从事卵子成熟基础研究的Edwards应用体外受精技术成功的产出了世界上首例试管婴儿，此后体外受精作为一项治疗不育症的临床技术在短时间内发展、应用，使社会和学术界对体外受精技术有了一个新的认识，并以此为契机加快了家畜体外受精技术的研究开发步伐［11］。中国的旭日干博士在充分探讨钙离子载体(IonophoreA23187)对精子获能诱导效果的基础上，利用超排卵子进行体外受精，通过移植产出了世界首例试管家畜－山羊［12］。此后，以钙离子载体IonophoreA23187为主的哺乳动物精子获能研究和家畜体外受精实验大量展开。旭日干博士回国后积极开展以家畜为主的体外受精研究，在1989年成功培育出中国首例试管绵羊和试管牛，并开创了该技术向产业化应用的先河。同时，笔者也就牛的体外受精进行了相关研究［13，14］。该技术的最大问题是作为实验材料的卵子来源，最初的卵子采集主要依赖于活体，但是由于数量和成本上的问题一直未能广泛应用，在这种情况下研究人员从屠宰场的废弃卵巢中收集未成熟卵子并取得成功，推动了家畜体外受精技术的研究和推广应用［2］。

3性别控制技术

性别鉴定(sexdetermination)和性别控制(sexingtechnology或sexcontrol)是两个不同的概念，前者是对已经发育到一定阶段的胚胎性别进行确认，而后者则是在胚胎受精前控制其性别的形成。从基础理论研究的角度来看，这些均是探讨生命发生过程中性别发生和分化的手段，但从产业实用角度看则可通过这两种技术人为地控制家畜的性别，提高生产效益。精子分离技术研究的兴起主要是随着人工授精技术的应用和普及而开始的［2］。对于家畜繁殖来说，如果能够把精子分离后用于人工授精，就可根据需要人为选择性别，如肉牛养殖户希望获得更多的公牛，而奶牛养殖母犊具有更高的经济利益。1979年，Moruzzi［15］提出以DNA作为性别选择的一种潜在标志，通过对多种动物精子染色体长度的测定，发现X精子和Y精子中的DNA含量都存在差异。1982年，Pinkel等［16］利用流式细胞仪测定已固定的小鼠精子细胞核，发现X精子和Y精子DNA含量的差异为3．2%。1983年，Garner等［17］利用同一技术测得部分哺乳动物X精子和Y精子DNA含量的差异为3．6%～4．0%。流式细胞分离法的原理是根据哺乳动物X精子和Y精子DNA含量的微小差别，通过荧光色素把精子头部染色后，被激光照射时的荧光发光量差别传送到计算机的识别系统，然后包含精子的缓冲液滴由控制系统赋于不同的电荷后，在通过电极区间时把X精子和Y精子偏开、并流入各自的接收容器内。1986年，Johnson等［19］改良了普通的流式细胞仪，使其专门适用于分离活精子，为利用改良的流式细胞仪分离X精子和Y精子奠定了基础。1989年，用流式细胞仪成功地分离兔子活的X精子和Y精子，并用分离的精子授精产下后代，这一技术取得了突破性和实质性的进展［19］。随后，在牛、猪和绵羊上都相继取得成功，至今已产下了数以万计的预选性别的后代。1989年美国的Johnson等［20］利用流式细胞法分离牛精子的有效性，日本的Hamano等［21］把改良后的流式细胞法用于牛精子头部的分离，得到了80%～90%的分离精度，另外笔者和Hamano［23］共同应用分离的牛精子进行了卵浆内精子注射(intracytoplasmaticsperminjection，ICSI)实验，得到首例分离牛精子的显微受精试管牛犊，并累计生产13头牛犊，性别控制准确率达90%左右。随后有研究将牛和羊的分离精子用于人工授精，并成功产出后代［24，25］。美国XY公司开发的精子分离专用设备SX—MoFlo，可以达到4000～5000个/s的分离速度，每小时可生产牛性控冻精5～6支，每支含200万个精子，精子分离纯度为85%～90%，已经能够商业化推广应用。但是由于机器昂贵、并且需要支付高额商业许可费，限制了这项技术的快速发展，这也是流式细胞法需要继续改进的主要原因。赛科星公司课题组从1995年开始牛精子分离技术相关研究［22］，内容包括精子染色条件、分离缓冲液设计、分离精子的冷冻保存、分离准确率检测，以及分离精子的受精和个体发育能力研究。研究结果表明以X/Y精子DNA含量为基础分离后的X或Y精子纯度可达到80%以上，该分离精子经过单精子注射技术受精后可发育为正常囊胚阶段(blastocyststage)。把分离的牛Y精子生产的胚胎移植到48头受体，并生产了世界首例分离精子－ICSI性控试管牛犊和试管马［26］。内蒙古大学和赛科星公司从2005年开始在中国进行以奶牛精子分离－性控技术的研究开发和产业化推广应用，特别是以哺乳动物受精原理为基础设计的“低剂量奶牛性控冻精生产新技术”使每台精子分离机生产效率提高了2倍以上，性控冻精的生产成本降低50%～70%。“十一五”期间在全国2700余个奶牛养殖牧场累计推广应用奶牛性控冻精超过150万支，已经生产奶牛母犊50余万头(图3)，总产值25亿元，充分显示了该技术的产业化应用前景和现实意义。与此同时，还研究开发了绒山羊和马鹿精子分离－性别控制技术并进行了产业化示范应用(图4)，取得了良好的试验结果和潜在的产业应用前景［2］。

4克隆技术

克隆动物不经过生殖过程产生，在遗传上和原来的个体完全相同。其实“克隆”现象在植物中的例子很多，如扦插、块茎繁殖等。克隆的基本技术是核移植，最初目的是为了探讨细胞中的细胞核(nucleous)和细胞质(cytoplasm)的相互关系。1962年，英国剑桥大学的科学家Gurdon研究组把青蛙的一个胚细胞移入一个已经去掉去掉雌、雄原核的受精卵内，首次在脊椎动物上取得了核移植的成功［29］。Gurdon教授的体细胞回归全能性的细胞重编程概念(cellreprogramming)不但开创了动物克隆技术，同时影响和推动了成体干细胞研究，并因为此贡献与日本科学家Yamanaka获得了2012年度的诺贝尔生理医学奖。真正意义的体细胞克隆哺乳动物的诞生是1997年英国罗斯林研究所(RoslinInstitute)的Willmut博士［30］领导的研究组成功繁育的雌性克隆绵羊多利(Dolly)。目前利用体细胞克隆的哺乳动物还有小鼠(美国)、大鼠(法国)、牛(日本、新西兰)、山羊(加拿大，中国)、猪(美国，日本)、骡子(美国)、马(意大利)、狗(韩国)、猫(美国)和鹿(新西兰)。动物克隆技术在农业领域的应用，主要围绕家畜育种和优良家畜增殖两方面的内容。以奶牛来说，由于个体差异产奶量相差很大。一般平均每头奶牛年产奶量为6000～8000kg，但是极个别奶牛的产奶量可达20000kg，几乎是正常奶牛的2．5倍［2］。自20世纪70年代以来，由于人工授精技术的普及，奶牛品质的改良主要是选择优秀的种公牛，以冷冻精液的形式与母牛配种，这是家畜改良的一次革命。但是任何技术都有局限性。由于决定奶牛品质的因素来自父母双方，而超级奶牛的出现往往只限于一代，当它在繁殖时由于雄性遗传信息的参与改变了子代的性状，很难达到同等的产奶水平。体细胞克隆技术的不改变供体原有的遗传特征，从供体奶牛提供的体细胞克隆出的子代牛犊，在遗传特征上和超级奶牛完全相同，这样就可以大大提高复制超级奶牛的可能性。内蒙古大学和赛科星公司，从2008年开始奶牛克隆技术研究和引种繁育试验，先后成功克隆奶牛种公牛和高产奶牛以及我国首例克隆马鹿，并且把这些成果逐步应用到产业中［31，32］。

5转基因技术

动物转基因技术是指通过转移目的基因至动物受精卵或细胞内，或剪除、抑制部分目的基因，使目的基因在动物体内得以整合表达或抑制表达，以产生带有新的遗传特征或性状的转基因动物的技术。1971年，Jaenisch和Mintzb［33］将SV40DNA注射到小鼠囊胚，在发育的幼鼠体内检测到了SV40DNA序列的存在。1976年，Jaenisch［34］又报道了通过反转录病毒感染小鼠胚胎，使病毒DNA整合到小鼠基因组并传递给后代。这还不是真正意义上的转基因动物，因为外源DNA只在小鼠的少数体细胞中存在，且遗传到下一代的机会很小。1980年，Gorden等［35］首先将纯化的DNA注射到小鼠的受精卵原核获得了转基因小鼠。1982年，Palmiter等［36］利用相同的方法，将大鼠生长激素基因注射到小鼠原核期胚胎，获得体重为正常小鼠2倍转基因“超级鼠”。这一结果发表在Nature上，引起了全世界同行业领域的轰动。由此，原核期显微注射法成为一种最可靠和最常使用的转基因动物制作方法，并很快在家畜上得到应用。1985年，Hammer等［37］在Nature上公布利用该方法培育出世界上第一只转基因绵羊。1990年12月，美国GenzymeTransgene公司用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白(hLF)的cDNA构建了转基因载体，通过显微注射法获得了世界上第一头名为Herman的转基因公牛，该公牛与非转基因母牛生产转基因后代，1/4后代母牛乳汁中表达hLF［38］。1992年，荷兰的Genpharm公司用同样的方法培育出牛奶中hLF达量为1000μg/mL的转基因牛;Berkel等［39］在此技术基础上进行改进，培育出的hLF转基因牛中牛奶乳铁蛋白表达量高达2800μg/mL。小鼠体内实验表明，转基因牛奶中的hLF与天然人乳中的hLF具有相同的生理学功能，表明利用转基因动物乳腺生物反应器生产hLF是可行。随着这些研究的不断深入，转基因动物研究于20世纪90年代进入蓬勃发展时期，其在生物医学领域及动物新品种培育方面显示出越来越广阔的应用前景。2007年，诺贝尔生理学和医学奖被授予给美国人MarioCapecchi、OliverSmithies和英国人MartinEvans，以表彰他们在分离小鼠胚胎干细胞以及打靶小鼠模型的建立等对改造动物体内特定基因的“基因打靶”技术等方面做出的突出贡献。动物育种的目标是要提高动物的遗传品质，如提高繁殖率、生长率、提高动物产品的营养价值，饲料转化率、利用率以及增加皮毛的质量，培育抵抗力强的抗病新品种等。2006年，Lai等［40］通过体细胞克隆技术，成功培育出fat-1转基因猪，ω-3的平均含量达到了野生型猪骨骼肌不饱和脂肪酸含量的4～8倍。这种转基因猪不仅本身的健康状况和抗病能力因高含量的ω-3得以提高，更主要是所提供的肉等食品在满足人们的膳食需求的同时，还可以预防和治疗人类心脑血管疾病、提高免疫力。

6干细胞技术

干细胞(stemcell)是指来自胚胎、胎儿或成体的有持久或终身自我更新能力的细胞，它能产生特异的细胞类型形成个体组织和器官。从19世纪开始，科学家们就已经了解到干细胞的存在，但是广岛和长崎事件之后，干细胞研究才真正发展起来。1998年，威斯康辛州立大学的Thomson等［41］首次从人囊胚内细胞团中建立了人胚胎干细胞系(embryonicstemcells，EScell);Gearhart等［42］从流产胎儿生殖腺组织分离并建立了胚胎生殖系干细胞系(embryonicgermcells，EGcell)。2007年末，威斯康辛州立大学Thomson研究小组和日本京都大学ShinyaYamanaka领导的科研团队，分别宣布已成功将成人皮肤细胞诱导成多潜能干细胞(inducedPluripotentstemcell，iPS细胞)［43］，这一发现揭开了干细胞研究的新篇章。内蒙古大学和赛科星公司与英国剑桥大学繁育生物学研究所(TheGurdonInstituteofCambridgeUniversity)合作开展了小鼠新型干细胞研究，分别在《Nature》和《CellStemCell》发表了具有重要影响力的成果［44，45］。与此同时，本研究组与英国剑桥Sanger研究所合作，以piggyBac转座子(CAG和TRE2套驱动系统)为媒介进行牛体细胞iPS诱导研究，将为牛的品种改良和提高牛的各项生产性状发挥重要作用［46］。

7展望

最早的家畜繁育生物技术应用是从20世纪60年代开始的牛人工授精，它为牛的品种改良作出了巨大贡献，到目前为止也是应用数量最多、产业效益最大、推广应用最成功的家畜繁育生物技术。胚胎移植技术目前比较成熟，但是由于成本较高主要用于品种引入或国际间的品种交流。克隆技术目前虽然在大部分家畜取得成功，但由于尚存在许多基础理论问题悬而未决仍然处于应用研发阶段。动物转基因技术在我国的几种大动物也取得了成功，目前国家已开展其生物安全性评价，但是介于目前食品安全的社会舆论质疑，国家的态度非常谨慎，因此很难在短时间内产业化应用。从目前我国的家畜产业发展和需求来看，如奶牛需要大量的良种母犊和高遗传品质的种公牛、肉牛行业需要经济效益更高的公犊和高遗传品质的种公牛，绒山羊养殖和我国养鹿业需要繁育更多的雄性后代，因此性别控制为基础的人工授精技术仍然是行业需求的主流技术。与此同时，转基因、克隆和动物干细胞技术在我国家畜育种方面具有潜在的产业价值和应用前景，预计在未来5～10年内会对我国畜牧业发展产生重要的影响。

作者：李喜和单位：内蒙古大学蒙古高原动物遗传资源研究中心