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牛血清蛋白与纳米金颗粒的作用

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《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期

1结果与分析

1.1BSA与AP-AuNPs的物理吸附结果电泳检测蛋白质可以通过物理作用吸附在纳米颗粒表面。从图1可以看出,从左至右,随着BSA浓度的增加,BSA与AP-AuNPs的吸附量也随之增多。通过与纯的AP-AuNPs相比较我们认为,图中与AP-AuNPs在同一水平位置的条带为没有吸附上BSA的AP-AuNPs,图中微滞后的条带为吸附上一条BSA的AP-AuNPs。选取吸附1个BSA的样品进行分析。

1.2蛋白酶K酶切AuNPs-BSA的电泳检测结果本文中选取蛋白酶K(proteinaseK,ProK)对吸附在AP-AuNPs表面的BSA进行酶切。与AP-AuN-Ps-BSA相对比,随着ProK浓度的增加,AP-AuNPs-BSA的迁移率逐渐的增大,但最终还是小于AP-Au-NPs的迁移率,说明吸附结合在AP-AuNPs表面的BSA片段随着ProK浓度的增加而减少,但是还是有部分BSA的片段吸附在AP-AuNPs的表面,没有受到ProK的酶切(图2)。

1.3SDS洗脱及吸附在AP-AuNPs表面肽段的PAGE胶鉴定十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂。用10%的SDS对AP-AuNPs-BSA(酶)进行处理。通过2%的琼脂糖凝胶电泳我们看出,10%的SDS可以将吸附在AP-AuNPs表面的蛋白片段洗脱下来(图3A)。然后将洗脱后的样品进行SDS-丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳,来对洗脱下来的蛋白多肽片段进行鉴定。从图3B中我们可以看出,经过SDS洗脱的后的样品中,在分子量约26kD处,有一条带出现,经与其它的样品比较,我们认为,该条带则为吸附在AP-AuNPs表面的BSA片段。

2讨论

本实验选取BSA与AP-AuNPs通过简单的物理吸附作用结合在一起,通过琼脂糖凝胶电泳结果可以看出,BSA可以稳定地吸附在AP-AuNPs的表面。在经过蛋白酶K酶切的电泳结果可以推测,BSA稳定的吸附在AP-AuNPs的表面是BSA中的一段氨基酸序列吸附在AP-AuNPs的表面所导致的。在经过SDS洗脱及SDS-PAGE电泳结果证明,BSA与AP-AuNPs是通过BSA的一段固定的多肽序列结合在AP-AuNPs所到导致的。该实验结果的发现,对于功能化的纳米颗粒在生物体内高效、稳定的应用奠定了坚实的基础。

3材料与方法

3.1AP合成AP合成的方法参照文献(Zhangetal.,2011)。简要概述:称取3.084g(15mmol/L)的聚异丁烯马来酸酐置于500mL的圆底烧瓶中,2.7g(15mmol/L)的十二胺干粉溶于100mL的四氢呋喃后与聚异丁烯马来酸酐混合,超声,使得溶液完全澄清。将混合液55~60℃加热、搅拌1h。用旋转蒸发仪将溶液浓缩到30~40mL后搅拌、过夜。次日,将溶液完全抽干,加入40mL的氯仿重新溶解。最终得到单元结构浓度(Cmononier)为0.5mol/L的两性聚合物。

3.2有机相AuNPs的合成合成方法参照文献(Linetal.,2008)。简要描述:称取2.17g四辛基溴化铵溶于80mL的甲苯中。称取300mg氯金酸溶于25mL的超纯水中。将两者混合至分液漏斗中,轻微震荡后弃水相,将有机相转移到圆底烧瓶中。称取334mg硼氢化钠溶于25mL的超纯水中,并迅速的加入到有机相中,搅拌60min后转移到250mL的分液漏斗中,分别加入NaCl、NaOH洗涤3次,弃水相后在转移到250mL的圆底烧瓶中,磁力搅拌,过夜。加入10mL十二烷硫醇,65℃水浴加热,搅拌3h。分装在40mL的小瓶中,2000r/min离心5min,收集上清。加入等体积的甲醇,2000r/min离心5min,弃上清,晾干,加入氯仿重新溶解。

3.3AP包裹AuNPs包裹的方法参照文献(Zhangetal.,2011)。简要概述:根据每个AuNP的有效表面积每平方纳米含有200个polymer单元结构比例混合。每个AuNP的有效表面积的计算方法为:Aeff=4•仔•(deff•2-1)2,其中的deff为油相纳米金颗粒的有效动力学直径。由于AuNP和polymer的体积小,密度大,使得它们在溶液中分布比较密集。由于氯仿挥发的太快,在进行真空抽气时不能够将polymer均匀的包裹在AuNP表面。在进行包裹时,先加入少量的氯仿有利于将polymer均匀的包裹在AuNP表面,真空抽气直到将氯仿全部抽干。加入适量的SB12缓冲液进行搅拌,直到混合物完全溶解且澄清。这样就将油相的AuNP转移至水相中(AP-AuNP)。

3.4BSA与AP-AuNPs的物理吸附实验取PCR管分别编号1~10,按表1中比例加入AP-AuNPs与BSA混匀,反应体系为30滋L,不足由超纯水补齐。室温下反应30min。

3.5经过酶切后AP-AuNPs表面肽段的回收将经过酶切后的样品用高效液相色谱法仪(HPLC)进行纯化,在紫外检测波长520nm处将样品回收,用超滤管4000r/min离心,浓缩。将浓缩后的样品按照体积比1:1的比例加入10%的SDS,混合静置1h。用5%的浓缩胶、电压20V/cm电泳70min,在用15%的分离胶,电压为60V/cm进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的检测,电泳100min。由于水相纳米金颗粒(AP-AuNPs)太大以至于不能够进入到胶里,而肽链能够直接进入到胶里进行检测。

作者:刘雨双钟睿博张萍白志军张峰单位:内蒙古农业大学生命科学学院

基因组学与应用生物学杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次
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