猪无透明带卵母细胞的优化范文

《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期

1结果与分析

1.1不同浓度的链霉蛋白酶消化卵母细胞后极体贴附率在不同链霉蛋白酶浓度下的细胞恢复率较好，由表1可知，浓度为2mg/mL链霉蛋白酶消化卵母细胞后极体贴附率显著高于其它浓度消化卵母细胞的极体贴附率，1mg/mL、2mg/mL两个浓度处理组的后期发育的乱列率显著高于其它浓度处理组(p<0.05)，详见图1。

1.2不同电场强度对无带卵母细胞孤雌激活效率的影响比较三组不同电场强度40V/mm、60V/mm、80V/mm，对卵母细胞孤雌激活效率的影响，由表2可知无带卵母细胞在三组场强激活后的卵裂率差异不显著，但80V/mm场强激活后的囊胚率显著高于其它两组的囊胚率(p<0.05)。

1.3不同脉冲次数对无带卵母细胞孤雌激活效率的影响在相同场强相同脉冲时程(60V/mm,80滋s)的条件下，比较不同脉冲次数1次、2次、3次对无带卵母细胞孤雌激活效率的影响，由表3可知无带卵母细胞在三组不同的脉冲次数中激活后的卵裂率差异不显著，但2次脉冲激活后的囊胚率显著高于其它两组的囊胚率(p<0.05)。

1.4不同微穴大小对无透明带胚胎的容纳能力比较了底部直径约为150滋m，深度约为200滋m，简称(1)；底部直径约为l20滋m，深度约为150滋m，简称(2)，两种不同微穴大小对无透明带胚胎的容纳能力的大小。由表4可知，无透明带孤雌激活胚胎在两种穴中容纳的卵裂率差异不显著，但在(2)穴中容纳的囊胚率略高于在(1)穴中容纳的囊胚率，但差异不显著，详见图2。

2讨论

透明带是围绕在卵母细胞外周的糖蛋白基质，对卵母细胞的成熟，胚胎的发育起着重要的作用。自从手工克隆技术问世以来，颠覆了一个传统的概念：透明带是胚胎发育过程所非必需的。Vajta等(2003)研究表明在有血清存在的条件下，即使卵母细胞的数量很多，用链酶蛋白酶消化透明带是一种高效而无损害的方法。很多研究者都用3.3mg/mL链酶蛋白酶消化卵母细胞的透明带(Vajtaetal.,2004;Lietal.,2006;Duetal.,2007)。本研究得出的最适宜透明带消化的浓度为2mg/mL，得到的极体贴附率，卵裂率最高。这可能与卵母细胞本身的质量，实验室自身的体系，操作者的操作程序等因素有关。影响猪卵母细胞孤雌激活的因素有很多，比如激活液的种类、激活方法、电参数、激活时间等等，卵母细胞的活化是由这些因素的共同起作用的。其中电激活方法比较常用，Miyazaki等(1986)研究认为对卵母细胞施加电场时，其透明带会出现微孔，通过诱导激活IP3系统，释放钙库中的Ca2+，从而激活卵母细胞。Fissore等(1992)研究表明电场强度、电脉冲次数等因素通过对细胞内Ca2+的变化以及卵母细胞对Ca2+敏感性的调节从而影响卵母细胞的激活。因此电激活的场强，脉冲参数对卵母细胞的活化是相当关键的。对于无透明带保护的卵母细胞孤雌激活的参数更值得关注。Kragh等(2005)研究表明用低场强60V/mm激活无带卵母细胞的效率比激活完整透明带的要高。本研究得出的低场强激活无带卵母细胞的效率更高的结论与此是一致的。Collas等(1993)研究认为多次使用电脉冲引发Ca2+离子持续内流，达到真实模拟正常受精过程Ca2+的节律性脉冲升高，从而使得卵母细胞彻底激活。因此增加电脉冲次数，其激活率明显升高。Zhu等(2002)研究表明猪卵母细胞孤雌激活中使用3次脉冲得到的囊胚率最高。Feltrin等(2006)在牛的手工克隆中使用2次电脉冲激活无透明带胚胎得到了较高的囊胚发育率。本试验无带卵母细胞的激活，得到的最佳脉冲次数为2次，与Feltrin等(2005)的研究结果相符合。培养无透明带胚胎的方法有：微滴法和微穴法。Vajta等(2000)研究表明微穴培养法适合透明带完整以及无透明的胚胎培养，而且微穴法卵裂率和囊胚率均显著高于微滴法(20.98%vs12.77%,p<0.05)。Vajta等(2000)在牛上微滴法培养单个无带胚胎囊胚率达29%，而本试验的囊胚率也达到20.68%，可能由于物种不同囊胚率略有差异，但与其研究结果基本一致。目前国内对于无透明带胚胎培养最佳微穴大小的报道较为少见，Feltrin等(2005)研究表明小尺寸微穴(内径130滋m,深度150滋m)中胚胎发育的卵裂率(80.9%vs64.1%)及囊胚率(25.3%vs11.9%)都高于大尺寸微穴(内径280滋m,深度250滋m)的发育率。本研究的试验结果也表明体积较小的微穴能较好地容纳无透明带囊胚，其囊胚率略高于较大微穴的囊胚，但两者的卵裂率差异不显著，与前者的研究结果基本一致。

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1主要试剂耗材TCM-199为GICO公司生产，胎牛血清(FCS)为Hyclone公司生产，除特别注明外，其它所有无机盐和生物化学试剂均为Sigma公司生产。配制溶液的三蒸水均为南宁本地水。实体显微镜(日本NIKON)，CO2培养箱(ThermoLifeScience)，融合槽型号BTX-450(SanDiego,USA)，卵母细胞成熟培养皿：35mm及60mm塑料平皿(BDFalcon,USA)，胚胎聚集针DN-10。

3.1.2卵母细胞成熟猪的卵巢来源于南宁市屠宰场，装入含有双抗(青霉素、链霉素)25~35℃的生理盐水中，用保温壶4h之内送回实验室。用10mL的注射器抽取直径为2~6mm的卵泡，经沉淀后收集有3层颗粒细胞包被的卵丘卵母细胞复合体(CoCs)，经体外成熟(IVM)44h后，收集有第一极体的成熟卵母细胞用于实验。

3.2实验方法

3.2.1消化透明带根据试验的要求设置不同的链霉蛋白酶浓度进行透明带的消化，待其恢复成圆形挑出留作后续试验。

3.2.2电激活根据试验的要求设置不同的电激活参数，在电融合槽中对卵母细胞进行激活。

3.2.3化学激活将融电激活后的卵母细胞放入含5滋g/mLCB和10滋g/mLCHX的PZM-3激活液中激活，每滴激活液中放入1枚重构胚，激活4h。

3.2.4胚胎的培养将激活后的胚胎转移到预先在CO2培养箱中平衡至少4h并且有石蜡油覆盖的PZM-3中的微穴中。微穴的制备：用胚胎聚集针在四孔板底部均匀旋转扎微穴，微穴大小根据试验的要求设置，每个微穴中放入1枚胚胎。48h观察卵裂率，160~168h观察囊胚率。

3.3试验设计试验一：比较不同浓度的链霉蛋白酶1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL消化卵母细胞后极体贴附率及卵裂率。试验二：比较不同电场强度(40V/mm,60V/mm,80V/mm)对无带卵母细胞孤雌激活效率的影响。试验三：比较不同脉冲次数(1次,2次,3次)对无带卵母细胞孤雌激活效率的影响。试验四：比较不同微穴大小对无透明带胚胎的容纳能力。

3.4数据统计所得数据由SPSS软件进行统计分析，试验每重复一次均为同一批次试验，使用相同来源的卵巢和试验条件，所有试验至少重复4次。

4结论

消化透明带的最佳链霉蛋白酶浓度为2mg/mL；最佳电激活参数为：70V/mm电压，80滋s脉冲时间：2次脉冲；较适宜容纳孤雌激活胚胎的微穴大小为：底部直径约为l20滋m，深度约为150滋m。作者贡献吕玲燕负责论文初稿的撰写；孙俊铭和陆杏蓉负责数据的统计分析及整理；潘翠玲和关志惠协助试验的开展；潘天彪、崔奎青和谢炳坤负责本文构思、审阅、修改、定稿。致谢本研究由国家自然科学基金(31160457)和广西畜牧研究所基本科研业务费项目基金(桂牧研科2014-02)共同资助。

作者：吕玲燕孙俊铭陆杏蓉潘翠玲 关志惠潘天彪谢炳坤单位：广西壮族自治区畜牧研究所广西家畜遗传改良重点实验室广西大学亚热带生物资源保护利用国家重点实验室广西壮族自治区水牛研究所