转染基因对同种大鼠皮肤移植的影响范文

【摘要】目的构建携带免疫调节因子vIL-10cDNA的真核表达载体，转染骨髓基质干细胞。筛选后对大鼠进行腹腔种植，4周后移植同种异体全层皮肤，观察大鼠对异体皮肤的免疫排斥反应。方法PCR扩增原核载体PET-28α/vIL-10，获得目的基因vIL-10，目的基因在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3.1(+)，转染大鼠骨髓基质干细胞。用G418筛选得到vIL-10高表达的细胞，腹腔种植于大鼠体内，对照组为未转染的骨髓基＋质干细胞。四周后异体植皮，7d后拆线、观察皮肤生长情况并采血使用流式细胞学技术分析外周血中CD3、＋＋CD4、CD8细胞百分数。结果vIL-10cDNA真核表达载体成功转染并表达于骨髓基质干细胞；同种异体植皮一周后应用vIL-10cDNA真核表达载体可以提高大鼠移植皮肤的存活质量；通过流式细胞仪对淋巴细胞亚型分析++++结果显示，应用vIL-10cDNA真核表达载体的大鼠血液中CD3/CD4绝对数值、CD4/CD8的比值均比对照组和空白组高。结论转染vIL-10基因可以降低大鼠全层皮肤移植后的免疫排斥反应。

【关键词】病毒白细胞介素-10；骨髓基质干细胞；免疫排斥反应；皮肤移植

既往研究表明，异体皮肤移植有望成为解决烧伤病人皮源不足问题的有效方法，但异体间的免疫排斥反应一直是现在医学难以跨越的鸿沟。vIL-10被认为是一种抑制同种异体移植免疫排斥反应的较理想细胞候选因子，而骨髓基质干细胞（MSCs）可以在体内微环境的诱导下分化为成纤维细胞和角朊细胞，且因其具有来源可靠、体外易扩增及不涉及伦理问题等优点成为首选种子细胞。异体移植的成功与否主要取决于个体间的免疫排斥反应的大小，我们通过构建vIL-10的真核表达载体，转染骨髓基质干细胞，植入大鼠体内，观察vIL-10在MSCs中的高表达对异体移植间的免疫排斥反应有无抑制作用。

1材料与方法

1.1材料

成年Wistar大鼠购自山东省实验动物中心。DH-5α大肠杆菌菌株和表达载体pcDNA3.1(+)均由潍坊医学院免疫学教研室梁淑娟博士惠赠。PET-28α/vIL-10质粒由福州总医院实验科吴玉水博士惠赠。脂质体转染试剂Lipofectamine2000、G418sulfate、DNA限制性内切酶和DNA连接酶分别购自美国invitrogen公司、加拿大BBI公司及MBI公司，UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒、UNIQ-10柱式胶回收试剂盒、UNIQ-10柱式质粒少量抽提试剂盒、AMVsinglestepRT-PCRkit均购自上海生物工程公司。Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-ratCD3、Phycoerythrin（PE）anti-ratCD8a、PEanti-ratCD4均购自BD公司。

1.2真核表达载体pcDNA3.1(+)/vIL-10的构建和纯化

根据Genbank提供的EB病毒基因组DNA中编码的vIL-10的BCRF1基因序列，PrimerPremier5.0软件设计针对该序列的上下游引物。对引物分别引入EcoRI、XhoI酶切位点及保护碱基，同时在上游引物引入起始密码子以提高目的基因与质粒表达载体连接的效率，上游引物命名为P1（5'-CGGAATTCATGGAGCGAAGGTTAGTG-3'），下游引物命名为P2（5'-CGCTCGAGTCACCTGGCTTTAATTGT-3'），通过PCR法扩增目的基因，经EcoRI、XhoI酶切回收目的基因片段并与pcDNA3.1(+)酶切载体连接，连接产物转化感受态DH-5α大肠杆菌，菌落PCR鉴定、质粒抽提pcDNA3.1(+)/vIL-10后酶切、测序鉴定，得到正确连接的重组体。

1.3MSCs体外分离和培养

将大鼠脱颈处死后置于75%酒精中浸泡10min，无菌条件下分离出股骨和胫骨。用DMEM培养基反复冲洗大鼠骨髓腔，将骨髓液吹打制成单细胞悬液并通过200目不锈钢滤网过滤，1500rpm离心5min，52以4×10/cm接种于DMEM培养基（含10%胎牛血清）中，置于37℃、5%CO、饱和湿度恒温培养箱2中培养，隔天换液，待10-14d细胞生长融合成片后，传代培养。

1.4vIL-10高表达细胞的筛选

按照LF2000脂质载体转染试剂盒说明，高纯度的真核表达载体pcDNA3.1(+)/vIL-10转染生长良好的第二代MSCs，在浓度不断升高的含G418的培养基中生长，最终得到能抵抗G418浓度为300㎎/L的细胞，分别命名为G418-100、G418-200、G418-300。

1.5转化细胞中vIL-10的表达

UNIQ-10柱式骨髓基质干细胞的总RNA抽提以未转染的骨髓基质干细胞为对照，收集转染组与对6照组各约1×10个细胞，加入350μlRLTSolution，震荡裂解，收集细胞总RNA。将得到的RNA在微量核酸定量仪上测定OD和OD值，计算OD/OD比260280260280值，分析总RNA纯度。取10μl作为模板RNA，通过RT-PCR法扩增目的基因，反应结束后取5μl样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6动物模型实验

取20只Wistar纯种大白鼠，体重200-260g，鼠龄3-5个月，随机分为三组：实验组（A）、阴性对照组（B）、空白对照组（C）。胰酶消化G418筛选后的高表达骨髓基质干细胞，PBS洗涤3次，42PBS重悬，得到6×10/cm的细胞悬液；按1ml/只腹腔注射于实验组大白鼠，阴性对照组注射等量未转染的骨髓基质干细胞悬液，空白对照组注射等量生理盐水。合笼饲养4周。异体植皮取A、B、C组Wistar大鼠各一只做为供皮组，腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g），取皮备用。同法麻醉其他实验组大鼠，剪除背毛，消毒局部皮肤，成品字形在背部做三个直径约1.2cm的圆形全层皮肤缺损。在缺损处分别植入A、B、C供皮组皮肤，打包加压缝合。同法处理对照组和空白组大鼠。

2结果

2.1重组载体pcDNA3.1(+)/vIL-10的构建及鉴定

以原核质粒PET-28a/vIL-10为模板，利用pfuDNA聚合酶的高保真性能，扩增vIL-10基因。产物回收纯化后，经EcoRI和XhoI限制性酶切，获得目的基因片段，同时对pcDNA3.1(+)进行EcoRI和XhoI限制性酶切，获得表达载体大片段，纯化的目的基因酶切片段和表达载体酶切片段，按照3~5：1比例进行连接构建后，转化DH-5α感受态菌株，挑取单个阳性菌落，单菌落培养后，进行菌落PCR鉴定（图1），PCR阳性者进行小量质粒抽提后，再利用EcoRI和XhoI进行限制性酶切鉴定，可见切出一大小约510bp的目的基因片段，与预期片段大小符合。最后将重组质粒做DNA序列分析，确认获得pcDNA3.1(+)/vIL-10真核表达载体。2018年第24卷第6期高学军等转染vIL-10基因对同种大鼠全层皮肤移植的影响•633•

2.2MSCs的体外培养

接种24h后可见成纤维状细胞以散在方式贴壁生长，多数为梭形的成纤维状细胞，也可见一些圆形的内皮样细胞，传代后细胞基本呈均匀性生长（图2）。

2.3总RNA抽提和目的

基因RT-PCR扩增结果（图3，4）

2.4异体植皮（图5）

2.5植皮一周后大体观察（图6)

全部实验动物在术后均未发生感染、体液渗出等不良反应。伤口包扎对动物的活动亦无明显影响。摄食、饮水，排便情况正常，均成活至完成实验。实验组移植皮肤与正常皮肤边界相互融合，颜色比正常皮肤红润，移植皮肤与创面黏附较好；对照组和空白组移植皮肤有少部分与正常皮肤边界融合，四周有少许结痂，创面黏附不如实验组，移植物颜色较正常皮肤深。

2.6流式细胞仪对淋巴细胞亚型分析结果

T淋巴细胞，主要杀伤病原体感染细胞及肿瘤细胞，其表面标志物CD3，与TCR形成复合体，是T细++胞识别抗原和转导信号的主要单位。CD3/CD4：辅++助性T细胞，CD3/CD8：杀伤性T细胞，++CD4/CD8的比值：评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷病人的免疫状态。++流式结果显示：实验组CD3/CD4绝对数值、++CD4/CD8的比值均比对照组和空白组高。流式细胞检测结果，实验组：A.001右上角为CD4/CD3、CD8/CD3双阳性T细胞，分别占淋巴细胞的27.32%、25.72%；阴性对照组：CD4/CD3、CD8/CD3双阳性T细胞，分别占淋巴细胞的10.41%、27.05%；空白对照组：CD4/CD3、CD8/CD3双阳性T细胞，分别占淋巴细胞的14.49%、21.94%。

3讨论

vIL-10是EB病毒编码的一种人白细胞介素[1]10（IL-10）的类似物，vIL-10可直接作用于T细胞，抑制B7受体如CD28、CTLA4介导的共刺激信号[2]。vIL-10作为一个具有免疫抑制作用的细胞因子[3]，在器官移植方面获得广泛研究。局部转染vIL-10可导致机体对同源和异源移植肿瘤不排斥，用vIL-10蛋白处理骨髓树突状细胞或用逆转录病毒转[4]导vIL-10可使T细胞功能降低。大量不同的T细胞亚群已被证实具有体内外免疫[5]++抑制作用，CD3/CD4：辅助性T细胞可分泌不同的细胞因子，具有辅助其它免疫细胞分化和调节免疫++应答的作用。CD3/CD8：杀伤性T细胞，它在T细胞++免疫应答中发挥重要功能。CD4/CD8比值可用于评价那些自身免疫失调或被怀疑免疫失调或已知患有++免疫缺陷病人的免疫状态，CD4/CD8升高见于自身[6-7]++免疫性疾病、免疫耐受等。CD4/CD8降低见于病[8-9]毒感染，恶性肿瘤，再生障碍性贫血等。骨髓基质干细胞是起源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs由于具有易获取、体外扩增迅速、容易转染等特点而[10]成为理想的基因治疗载体。目前的干细胞移植治疗通常分为3种：增殖后直接移植、诱导分化后移植和干细胞经基因修饰后移植。将各种因子的基因通过转染技术,使其在种子细胞内表达，然后将这种转染细胞用于组织工程构建,在实验研究中已获得成[11]功，比如BMP22、BMP24、BMP27、BMP-2基因转染诱导成骨细胞，可加速成骨过程及骨修复能力。不同基因修饰后，干细胞可能会出现不同程度的细胞生物学和/或分子生物学的变化，这种基因相关的个性改变应逐一进行检验，以确定干细胞为种子的细胞治疗和组织工程治疗的有效性。本实验采用的是构建真核表达载体直接转染骨髓基质干细胞，因此没有必要研究外源基因修饰后干细胞的生物学特性的改变。同种异体间的免疫排斥反应是异体皮肤移植失败的主要原因，诱导免疫耐受是增加移植皮片存活[5]的关键。目前应用同种异体和异种皮肤移植治疗大面积烧伤，因组织相容性不理想，会受到免疫排斥反应而被排斥，故只能作为暂时性覆盖创面之用。本实验中，通过构建携带vIL-10目的基因的真核表达载体，转染到骨髓基质干细胞中，腹腔注射于大鼠体内，4周后异体植皮，移植皮片存活质量提高以++及外周血CD4淋巴细胞数值升高，CD8数值降低，++CD4/CD8比值增高，这提示注射转染vIL-10的骨髓基质干细胞可以降低异体移植间的免疫排斥反应。本实验成功构建了携带vIL-10目的基因的真核表达载体，为同种异体皮肤移植基因治疗的动物实验研究提供了一个新的突破点。

【参考文献】

[1]张庆毅.转基因诱导移植耐受的研究进展[J].国外医学免疫学分册,2002,25(3):113-116.

[3]张宁,唐福林.vIL-10转基因治疗兔膝关节炎模型的试验研究[J].中国免疫学杂志,1000-484X(2006):11-1060-03.

[4]张宁,唐福林.携带vIL-10的逆转录病毒重组体的构建及体外表达研究[J].中国免疫学杂志，1000-484X(2005):12-0899-03.

[5]奚瑾.潘志强.CD4CD25调节性T细胞参与大鼠角膜移植免疫耐受的研究[J].中华眼科杂志,2007,43:1114-1118.

[10]冯一梅,徐辉.间充质干细胞基因转染的相关研究现状[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(11):2119-2121.

作者：高学军 陈振雨  蔡霞 单位：青岛大学附属医院