论小鹅瘟病毒PCR检测条件的优化范文

摘要:为了提高小鹅瘟病毒PCR检测的检出率，试验根据现有的小鹅瘟病毒基因序列，设计合成了1对特异性引物，以实验室中保存的小鹅瘟病料DNA为模板，对反应程序中的延伸时间、退火温度等循环参数进行优化，并进行了敏感性和特异性检测。结果表明:优化后的延伸时间为45s，退火温度为48.0℃;优化后的方法对小鹅瘟病毒可扩增出大小为550bp的特异性条带，对照毒株扩增结果均为阴性，其灵敏度为146.00pg/μL。说明优化后的PCR方法特异性强、敏感性高，反应时间明显缩短。

关键词:小鹅瘟;PCR;条件优化;DNA病毒;敏感性

小鹅瘟(goslingplague，GP)是由细小病毒科、细小病毒属中的鹅细小病毒(Gooseparvoviruse，GPV)引起的一种雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。该病主要发生于2周龄以内的雏鹅，具有发病率高、致死率高和传播速度快等特点。朱堃熹等［1］对40例典型病例进行了系统的病理解剖学研究，结果显示，该病的主要病变为急性卡他性－纤维素性坏死性小肠炎，可引起小肠梗阻。自1962年方定一［2］及其研究团队首次发现此病以来，多家研究单位研究和建立了GPV的PCR快速检测方法［3－6］，但其条件未能达到最佳，赵磊等［7］对GPVDNA的提取方法进行了优化，确定以微量法提取GPV核酸最具优势。本试验对GPVPCR检测的延伸时间、退火温度等循环参数进行了优化，并检测了特异性和敏感性，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1病毒Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅰ)、Ⅲ型鸭病毒性肝炎病毒(DHAV－Ⅲ)、鸭瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)、GPV、鸭圆环病毒(Duckcircovirus，DuCV)、番鸭细小病毒((Muscovyduckparvoviru，MDPV)、鸭副黏病毒(Duckparamyxoviru，DPMV)、新型鸭肝炎病毒(NCHV)，均由西南大学动物科学学院动物疾病快速诊断中心保存。

1.2主要试剂及仪器DNA提取试剂盒、rTaqDNA聚合酶、DL－2000Marker、TEBuffer，均购自宝生物工程(大连)有限公司;BiodropuLITE分光光度计，由西南大学动物科学学院动物疾病快速诊断中心提供。

1.3引物根据GPV的基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计1对寡聚核苷酸引物，序列为上游引物5'－CCAAGCTACAACAACCACATCTAC－3'和下游引物5'－CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC－3'，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4病毒DNA的提取取西南大学动物科学学院动物疾病快速诊断中心保存的GPV，参照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA。

1.5PCR检测方法的建立与优化反应体系:GPVDNA模板3μL，rTaqDNA聚合酶12.5μL，上、下引物各1μL，用7.5μLddH2O补至25μL。对反应程序中的延伸时间、退火温度等循环参数进行优化，确定最佳反应程序。设定延伸时间分别为15，30，45，60，75，90s;退火温度分别为38.0，39.8，44.3，47.2，48.0，54.5，61.5，65.0℃。

1.6PCR敏感性检测用BiodropuLITE分光光度计在OD260/OD280值下测得DNA原浓度为934.37ng/μL，用TEBuffer对原浓度DNA进行10倍梯度稀释至93.437pg/μL，再对浓度为934.37×10－2ng/μL的DNA进行2倍梯度稀释，分别测定每次稀释后的DNA浓度，并各取3μL加到反应体系中进行敏感性检测。

1.7PCR特异性检测用优化后的最佳反应程序对DHAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、GPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV的DNA或cDNA进行PCR扩增。

2结果与分析

2.1PCR检测方法的建立与优化对反应程序中的延伸时间、退火温度等循环参数进行优化，确定最佳反应程序。

2.1.1延伸时间的筛选保持其他条件不变，设定延伸时间分别15，30，45，60，75，90s进行PCR扩增，结果延伸时间为45s时扩增得到的条带最亮。

2.1.2退火温度的筛选保持其他条件不变，设定退火温度梯度为38.0～65.0℃进行PCR扩增，结果退火温度为48.0℃时扩增得到的条带最亮。

2.1.3PCR扩增根据2.1.1和2.1.2的筛选结果确定最佳的反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性1min，48.0℃退火1min，72℃延伸45s，共30个循环;72℃再延伸5min，12℃保存。

2.2PCR敏感性检测

结果显示，采用10倍稀释和2倍稀释的方法可在146.00pg/μL～934.37ng/μL范围内扩增出清晰的条带，浓度为93.437pg/μL时未扩增出条带。说明优化后的PCR方法检测GPV的灵敏度为146.00pg/μL。2.3PCR特异性检测结果显示，优化后的PCR方法能检测到标准阳性GPV毒株，而对DHAV－Ⅰ、DHAV－Ⅲ、DPV、DuCV、MDPV、DPMV、NCHV均检测不到特异性条带。

3讨论

小鹅瘟是导致雏鹅死亡的常见疾病之一，可造成巨大的经济损失，严重危害养鹅业的发展。目前，对GPV的检测技术主要有琼脂扩散试验［8－9］、酶联免疫吸附试验［10］、免疫酶斑点法［11］、免疫荧光试验［12］和PCR检测方法等。随着分子生物学诊断技术的不断发展，PCR快速检测方法省时省力，得到了认可并成为最常用的检测方式。本试验利用保存于实验室的GPV，对已有的小鹅瘟PCR检测条件进行优化，筛选出反应时间最短、反应效率最高的一组条件，特异性

作者：童艳梅；李娴妍；陈义旺；马晓强；顾江风；杨梦琪；刘雨；杨晓伟；赵光伟 单位：西南大学动物科学学院动物医学系