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中东呼吸综合征冠状病毒的检测

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《病毒学报》2016年第三期

摘要:

建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法。本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证。结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法最低检测限均能达到10PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好。对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标。本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性。

关键词:

中东呼吸系统综合征;冠状病毒;荧光定量RT-PCR;多重;检测

中东呼吸综合征是由中东呼吸综合征冠状病毒感染所致的急性呼吸道传染病,是继严重急性呼吸综合征冠状病毒后的一种新发现的感染力强、病死率高、可在人群当中传播的冠状病毒,病毒溯源分析提示其可能来源于蝙蝠或中东沙漠地区的单峰骆驼[1,2]。MERS-CoV为有包膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约30kb,该病毒基因组结构与其他已知的人类冠状病毒相似,至少含有10个开放读码框架(openreadingframe,ORF),编码病毒的多种结构蛋白和非结构蛋白[3]。与其他冠状病毒所致的肺部感染相比,MERS-CoV感染的临床表现没有特征性差异,因此MERS-CoV确诊病例的诊断需依据实验室病原学检测结果。MERS-CoV的实验室检测包括病毒核酸检测、抗原抗体检测及病毒分离鉴定[4-6]。其中,核酸检测方法中的荧光定量RT-PCR方法具有时间短、灵敏度高、特异性好等优势,是目前广泛应用于MERS-CoV感染筛查与实验室确诊的工具[7]。各国科学家相继建立了针对MERS-CoV多个靶标的单重荧光定量RT-PCR方法[8],主要包括N基因,E蛋白上游、ORF1b及ORF1a。世界卫生组织于2014年9月颁布MERS-CoV实验室诊断标准流程,认为ORF1b具有较好检测特异性,但推荐以病毒E蛋白上游一段基因作为临床样品的初筛检测靶标,两个靶标同时阳性可确认MERS-CoV阳性。我们实验室前期也已建立多种针对不同靶标的单重荧光定量RT-PCR方法[7],通过对中国首例MERS-CoV输入病例的检测发现:N2的检测灵敏度优于upE.为改进目前MERS-CoV核酸检测方法,本研究基于upE,ORF1b,N2三个靶标,建立了三种双重或三重MERS-CoV的荧光定量RT-PCR核酸检测技术,采用从荷兰伊拉莫斯医学中心引进的MERS-CoV病毒毒株[9]、上海市出入境检验检疫局提供的发热病人样品以及中国MERS输入病例的咽拭子和全血样品[7]做了临床验证。

一、材料与方法

1临床样品从荷兰伊拉莫斯医学中心引进MERS-CoV病毒毒株(hCoV-EMC)[3,9],进行病毒培养并将病毒培养物梯度稀释于适当缓冲基质(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所以统一使用的VTM病毒转运培养基)中,得到不同浓度的MERS-CoV病毒培养物稀释液,用于实验方案的检测下限的确定及灵敏度验证。上海市出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品,以及广东省中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的1份全血样品和3份咽拭子样品,均用于实验室实验方法的临床验证。病毒培养与送检样本经中国疾病预防控制中心BSL-3实验室分装灭活。感染其他常见呼吸道病毒并经实验确定的发热人员咽拭子样品[10](中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所保存)用于检测方法特异性的验证。

2样品核酸提取所有MERS-CoV病毒或临床样品首先经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所BSL-3实验室病毒灭活,其他样品在BSL-2实验室灭活病毒。每个样品均采用140μl进行病毒核酸提取,溶于60μl纯水,得到核酸样品提取液。

3方法设计

3.1引物及方案设计查阅文献与基因序列比对,选择基于upE,ORF1b,N2三个靶标建立双重以及三重MERS-CoV的核酸检测方案,引物设计及实验方案见表1。

3.2荧光定量PCR检测选取TaKaRa一步法荧光定量PCR试剂盒(OneStepPrimeScriptRT-PCRKit,宝生物),反应体系:2×RT-PCRbuffer12.5μl,TaKaRaExTagHS,引物(20μM)、探针(20μM)(参见表1),加水至20μl体系。分别加入样品核酸提取液、阴性对照各5μl。于BioRedCFX96实时荧光定量PCR系统设置反应程序:42℃5min,95℃10s,95℃10s,60℃45s,共40个循环,在60℃检测荧光。

3.3检出下限及灵敏度验证MERS-CoV病毒培养物进行滴度定量,然后灭活病毒培养物并进行倍比稀释,提取倍比稀释的病毒核酸稀释液样品,用于对各实验方案的检测下限和灵敏度的确认。

3.4特异性验证选取实验室保存的常见呼吸道病毒核酸阳性的临床咽拭子样品[10],对各实验方案的特异性进行验证,阳性样品包括有:HCoV-NL63,HCoV-229E,HCoV-OC43,HCoV-HKU1,流感病毒A/B型,人鼻病毒,呼吸道合胞病毒,副流感1、2、3、4型,腺病毒,人偏肺病毒,人博卡病毒。

3.5多重检测体系比较依据方案设计(表1),进行双重和三重荧光定量RT-PCR实验方法的确立,并分别与相对应的单重荧光定量RT-PCR方法进行比较验证。3.6临床样品验证采用上海市出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品,以及广东省疾病预防控制中心送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的1份全血样品和3份咽拭子样品进行实验室实验方案的临床验证。

 二、结果

1检出下限确定以6个倍比稀释的核酸稀释液样品为模板,每个梯度重复3次实验,优化多重体系后,方案一、方案二、方案三均能达到最低检测限为10PFU/ml,且不同检测批次具有较好的重复性,见表2。

2特异性分析针对upE/ORF1b/N2三个靶标的扩增曲线见图1。以其他常见呼吸道病毒阳性的临床样品核酸为模板,分别进行双重和三重荧光定量RT-PCR反应,结果分析后均无MERS-CoV核酸扩增信号,无交叉反应,特异性良好。3临床样品检测验证采用上海出入境检验检疫局送检的20份口岸发热人员咽拭子样品,以及广东省疾控中心送检的首例确诊为输入性MERS冠状病毒病人的3份咽拭子样品进行MERS冠状病毒检测方案进行验证,结果表明针对upE/ORF1b和upE/N2双靶标双色检测方法及upE/ORF1b/N2三靶标检测方法结果与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(N2/ORF1b/upE)检测结果一致,显示检测结果见表3,三种实验方案均有良好的特异性扩增动力学特点,见图1。Ct值N2靶标<upE靶标<ORF1b靶标(表3)。1份输入性MERS冠状病毒病人的全血样品的检测结果表明:只有含N2靶标的单重或多重荧光定量RT-PCR才能检出阳性。故三种MERS冠状病毒检测方案均可应用于MERS冠状病毒核酸检测,且含N2靶标的检测方案具有最好检测灵敏度,适合于初筛。

三、讨论

MERS-CoV于2012年9月在沙特阿拉伯首次被发现后,该病毒引起的MERS病例已出现在全球26个国家,主要分布在中东地区的阿拉伯半岛国家,非洲、欧洲、亚洲和美洲的一些国家也报告了一些旅行相关病例,2015年5月韩国一名确诊MERS-CoV感染患者输入中国,我国对其进行了准确及时的检测和监控,有效的控制了疾病的扩大和传播[7]。因此在对新发传染病进行诊断控制的同时,需要实验室提供快速有效的实验室病原学检测结果。多个研究和我们的实验结果表明:冠状病毒N基因靶标为最敏感检测靶标,我们的实验结果也表明:upE和ORF1b区靶标具有相近的灵敏度,但upE的灵敏性要略优于ORF1b,二者均可用于MERS-CoV的筛查和确诊实验[4-8]。MERS-CoV核酸检测中含N2靶标有较高检出率,适合于初筛,尤其在临床样本应用上明显优于基于upE单一靶标。同时依据世界卫生组织推荐的MERS-CoV实验室诊断标准及中国疾病预防控制中心2015年颁发的MERS-CoV感染实验室检测指南:临床病例样本进行核酸检测时,检测两个靶标同时阳性方可确认为MERS-CoV感染阳性。本实验室在前期工作基础上,通过荧光探针与反应体系的优化,本研究首次报道了基于MERS-CoV三个靶标(upE,ORF1b,N2)的双重或三重荧光定量RT-PCR检测方案,并采用病毒培养物与临床样本对新建立的多重核酸检测技术进行验证,表明其检测灵敏度(最低检测限为10PFU/ml)、特异性与重复性均较好,与前期建立的基于upE或N2的单重荧光定量RT-PCR检测相当,尤其是含N2靶标(N2/upE或N2/upE/ORF1b)的多重荧光定量RT-PCR,可以检出输入性MERS冠状病毒病人的全血样品中的低拷贝核酸,更适用于临床样品的初筛和确认实验。新发传染病出现时,由于其流行病学、病理学临床特征尚不明确,严重影响公共卫生安全和社会稳定,实验室作为临床科室不可缺少的后备检测力量应该有能力及时为新发传染病的诊断提供有效的手段。本实验室建立了三种新的多重荧光定量RT-PCR检测方案,为MERS-CoV感染提供了快速、灵敏及特异的实验室筛查与确诊工具,可以及时的为临床诊断提供实验室依据,这些新的实验方法的推广应用能够进一步提高公共卫生实验室的应对与防控MERS-CoV感染与传播的能力。

作者:牛培华 陆柔剑 蓝佳明 刘高山 王文玲 谭文杰 单位:中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所;卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

病毒学报责任编辑:杨雪    阅读:人次
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