百合响应非生物胁迫的分子机制探讨范文

摘要：非生物胁迫严重影响了百合的生产、生长发育过程，百合有应对高温、寒冷、干旱、高盐或激素ABA等非生物胁迫的能力，百合可以通过胁迫信号感知、信号激活、信号转录和转导，并通过一系列相应胁迫的基因的表达以及生理反应来响应非生物胁迫。百合对非生物胁迫的响应过程比较复杂，响应过程分为胁迫信号的接受与感受，信号的转导，转录调控基因的表达。本研究分别从转录组测序和蛋白质组学方面，对百合响应非生物胁迫的基因表达机理及百合在非生物胁迫分子机制成果进展进行总结阐述，并讨论了培育抗逆性强的百合品种的前景，为百合分子育种提供理论参考。

关键词：百合；非生物胁迫；信号转导；转录因子；差异

蛋白百合在中国市场是重要的球根花卉，不仅是世界著名的切花品种，也可以作为盆花栽培，同时也广泛应用于园林绿化建设中。但是，温度和干旱是限制百合地域分布的生态因子，非生物胁迫直接影响百合生长和发育及产量，甚至会引起百合生理失衡，是降低百合观赏价值的主要原因(黄洁等,2012)，因此非常有必要提升露地栽培百合的抗逆性。本综述从百合响应非生物胁迫分子机制方面的研究进行阐述，旨在为提升百合响应非生物胁迫提供研究基础和方向。

1百合对非生物胁迫的信号转导

百合受到低温胁迫后，细胞中的水分交换和营养吸收受到了极大影响；细胞膜的流动性、渗透作用、细胞质中的物质代谢、核酸的代谢组合都受到了直接影响。并对细胞的物质与能量代谢有一定的影响。但百合可以通过机体一系列的反应抵抗外界低温胁迫。百合对低温胁迫的响应脉络十分复杂，主要通过低温信号的感受、多种分支途径的信号转导、转录因子的转录调控、抗胁迫基因的表达、物质代谢与渗透作用等多种方式，从而令百合具有一定的抵抗胁迫能力(李宏宇等,2006)。低温信号可以通过非ABA、ABA及Ca2+信号等途径进行转导。许多研究已经验证得出了百合冷诱导途径和调控诱导的基因以及冷诱导转录因子，它们可以通过不同途径调控百合响应非生物胁迫，并具有十分显著的效果。

1.1百合在非生物胁迫下的Ca2+信号转导

百合在受到外界低温胁迫后，冷信号分子会与受体结合，并调节细胞代谢、运动、分化等一系列反应，因此了解信号分子的调节过程是探究冷信号传导途径的重要过程。百合细胞中的PIP1和PIP2是细胞质膜的组成成分之一，由它构成的膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP)可以衍生信使传导细胞外界冷信号因子。在低温条件下，PIP1和PIP基因可以通过编码质膜蛋白(Inositol1,4,5-trisphosphate(IP3))刺激百合中的蛋白激酶和钙离子Ca2+信号通路做出响应(Stieberetal.,2004)。在野生卷丹的转录组测序中，发现两个PIP基因(Contig1854,Contig1406)出现转录调控表达上调。当发生低温胁迫时，LlPIP1和LlPIP2基因可以编码质膜蛋白IP3刺激卷丹中的蛋白激酶和钙离子做出响应，因此LlPIP1和LlPIP2基因能够起到十分重要的信号转导作用。百合在低温胁迫下，细胞中的钙离子Ca2+作为第二信使在受到低温胁迫后，Ca2+浓度会迅速增加，并携带着低温信号从细胞外传递到细胞内，引起转录调控等一系列的信号转导与基因表达。在这一过程中，CDPK基因(钙依赖性蛋白激酶)是Ca2+通路重要的传感器。Wang等(2014a)通过对卷丹的转录组进行测序，能够发现在低温胁迫初期，两个CDPK基因表达量明显上调(Contig22048,Contig2751)，说明CDPK基因的与冷信号转导途径有关，它是可被冷信号激活的ABA诱导型启动子。

1.2百合在非生物胁迫下信号转导中ABA响应

植物响应外界非生物胁迫的过程较为复杂，激素脱落酸(ABA)能够在植物细胞响应低温胁迫中发挥重要的作用(黄云吉等,2015;姚攀锋等,2016)，它是百合响应外界低温胁迫的重要信号因子，一般是通过两大类信号通路调控：ABA依赖性途径(ABA-de-pendentpathway)和ABA非依赖独立的途径(ABA-in-dependentpathway)。一方面，ABA依赖性途径中内源ABA含量在冷诱导时期能够显著提升，意味着低温会刺激百合产生更多ABA信号因子，并促使ABA介入信号转导，ABA因子可以诱导相关基因表达量增加或者减少(AgarwalandJha,2010)。ABA依赖性途径的反应途径如下：在ABA依赖性途径中，磷酸蛋白酶(PP2C)的表达量逐渐下降，并显著影响了ABA信号的转导(FowlerandThomashow,2002)。在‘卷丹’的低温胁迫研究中，陈丽静等(2011)发现2个被鉴别的PP2C基因(Contig24025,Contig19208)在冷应激反应中的表达量降低，倍数变化仅为0.35，说明‘卷丹’中PP2C基因起到了转导ABA信号的作用。转录因子基因LlNAC和LlBZIP(Contig20596,Contig12014)能够作用于A-BA依赖性途径，使其表达量发生改变，变化倍数分别是0.46和1.56，紧接着它们可以促进生成LlNAC1蛋白和LlZIP蛋白(Yoshidaetal.,2002)。‘卷丹’在非生物胁迫下信号转录中的Ll1R-MYB1，LlR2R3-MYB，LlMYBR，19208LlAPL(Contig22140,Contig18508,Con-tig1641,Contig20641)是MYB家族的主要转录因子，其表达量变化倍数分别是1.01，6.30，1.85和2.92。因此可以说明，‘卷丹’在低温胁迫条件下，LlCBL，LlAP2/EREBP，LlNAC，LlBZIP和LlR2R3MYB基因的转导也能够在ABA信号通路中发挥出关键的效果。另一方面，非ABA途径可以依靠启动子诱导基因表达来反馈冷胁迫(ShinozakiandYamaguchi-Shi-nozaki,2007)。非ABA途径的冷诱导基因的启动子包含三个主要顺式作用元件，分别是CIS-actingelements，DRE(dehydration-reponsiveelement)/CRT(C-RepeaT)和ABRE(ABA-responsiveelement)，这三个启动子都会诱导下游胁迫基因的表达(Pangetal.,2013)。吴小萍等(2006)的研究表明，东方百合中LoCBF基因和‘卷丹’LlDREB1的表达量都发生了变化。根据陈丽静等(2011)的研究推测，DREBL基因可以和Ll-CIS基因(Contig8665)相结合，并诱导LlCOR12和LlDRE2(Contig13202_All,Contig12185)的表达量提升。另外，Liu等(2014b)的研究还发现了一个大基因家族LlAP2/EREBP(Contig10652_All)，LlERF2，LlERF3，LlERF5，LlERF10和LlmTERF转录因子都在非ABA途径进行表达。Wang等(2014a)研究证明了在适当的条件下，低浓度的外施激素脱落酸ABA可以使卷丹和东方百合‘Sorbonne’的部分基因表达量上调，能够在一定程度上促进百合提升抗寒及抗旱的能力。因此可以推测其原因为ABA激素可以刺激含有ABA应答元件(ABREs)的启动子区域的下游冷胁迫基因进行表达。该研究也验证了外施ABA激素可以提高百合体内抗氧化酶SOD和APX的活性，促进细胞膜的抗氧化系统发挥作用，并通过渗透调节作用防止细胞结构受到破坏，从而维持细胞的正常物质代谢。

1.3百合非生物胁迫下蛋白激酶的响应

由于外界低温环境会刺激卷丹细胞产生冷信号因子，细胞膜上的接收器或传感器(Sensor/Receptor)对冷信号因子进行传导，这时冷信号因子会在催化蛋白激酶的作用下从细胞质传递至细胞核(Pilaretal.,2008)，此时信号转导在蛋白激酶C和磷酸蛋白酶(PP2C)的双重促进下，能够诱导转录因子LlR2R3-MYB，LlNAC，LlAP2/EREBP，LlDREB1，LlBZIP等通过Ca2+通路和ABA依赖途径进行表达(Chinnusamyetal.,2007)。紧接着这些转录因子能够促进下游冷诱导基因LlNAC，LlZIP，LlERF，LlMYB-DNA蛋白，LlNAC1的表达来应对低温胁迫。转录因子也会诱导LlCLS，LlFAD3，LlP5CS，Llβ淀粉酶基因等基因的表达(孙红梅等,2005)，促进了细胞渗透调节作用和碳水化合物代谢等植物生理作用，从而使卷丹逐渐与低温环境相适应并具备较强的抵御低温胁迫的能力(Degenkolbeetal.,2012)。

2百合响应非生物胁迫响应的基因调控

2.1百合响应非生物胁迫的转录因子调控

在自然条件下，百合除了会受到低温胁迫，还会受到高温胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫和激素胁迫等非生物胁迫(Abioticstress)。近年来，随着环境恶化与极端天气的频繁出现，非生物胁迫对百合的生产与生长发育造成了严重制约与威胁，因此研究百合对非生物胁迫产生的响应与变化十分重要，探究百合对非生物胁迫响应的基因调控机理。转录调控对百合响应非生物胁迫起着承上启下的作用，并且转录因子(transcriptionfactor,TF)在转录调控中扮演着重要的角色。为了确保目的基因能够在特定的条件下表达出相应的蛋白质分子，转录因子在与顺式作用元件中的启动子进行结合时可以与其他相关蛋白相互影响，从而改变基因的转录过程(曹红利等,2012)，一方面可以增加或减少同类性状相关基因的表达量，另一方面也影响了若干与同类性状相关基因的表达，以更好地响应外界非生物胁迫。Iwase等(2011)对百合转录因子的研究表明，在非生物胁迫下，卷丹可以借助信号传递的方式对非生物胁迫信号做出应激反应，从而激发转录因子与相应的顺式作用元件进行结合，并转录表达相关蛋白基因，具体的转录因子包括LlNAC，LlWRKY，LlDREB，LlMAPK，LlAP2/EREBP等。当百合受到非生物胁迫的影响时，细胞传感器会接收到第二信号传感，从而改变细胞内的渗透压，并随后引发氧化应激反应(王晶懋,2015)。在这一过程中，细胞膜上面的调控功能基因和结构蛋白的基因如LlRTPK(受体丝氨酸threonine-protein激酶)，LlCLAVATA(受体蛋白激酶CLAVATA1)，LlPTA(phospholipid-transportingatp酶)，LlSOS(Ca2+传感器)，LlCDPKs(calcium-dependent蛋白激酶)开始进行表达调控。参与信号转导的转录因子包括：LlAP2/EREBP转录因子(乙烯反应元件结合蛋白)，LlDREB/CBF(脱水反应元件结合蛋白)，LlCBL5(CBL-inreracting蛋白激酶5)，LlWRKY(WRKY转录因子)，LlMAPK(增殖蛋白激酶)，LlGAGA(GAGA-binding转录因子)和LlR2R3-MYB(R2r3-myb转录因子)。这些转录因子可以向下游进行信号转导并诱导相关应激蛋白基因的反应和表达，主要诱导LlHSP，LlNAC，LlCOR12，LlNADPH和LlNAC1相关基因的表达(Ouellet,2002)，这些基因能够调控蛋白质合成、离子和水运输、活性氧的清除和解毒(图1)。另外，细胞内稳态的重建、增加细胞间渗透保护剂、膜的表达、聚胺类物质合成、碳代谢和细胞凋亡等都是百合细胞抵抗外界非生物胁迫不可或缺的一部分。

2.2百合响应非生物胁迫的下游胁迫基因分析

通过对百合的转录组测序，Wang等(2014b)发现了野生百合卷丹、东方百合‘Sorbonne’和亚洲百合‘Tiny’的非生物胁迫基因，其中冷胁迫转录因子基因有：LlAP2/EREBP、LlNAC1、LlR2R3-MYB等，与抗性相关的蛋白基因有LlNAC、LlHOT、LlMYBR、LlNAC1、LlLTR、LlLRR、LlDEA，以及GAGA，IAA-IAA，ABAABA等激素代谢相关基因。这些非生物胁迫基因对百合在非生物胁迫期间的信号转导、转录表达、抗性基因的表达及物质能量代谢都有直接或间接的作用，具有重要的参考价值(图1)。该研究对百合非生物胁迫基因Unigene进行了功能注释(表1)，发现它们与碳代谢过程、植物激素信号转导、次级代谢合成等胁迫响应机制有关，并与嘧啶代谢、核糖体形成、氨基酸合成、mRNA通路等信号调节途径关系密切(Liuetal.,2014a)。

2.3百合响应非生物胁迫的GO功能分析

在对野生百合‘卷丹’、东方百合‘Sorbonne’和亚洲百合‘Tiny’进行同源性分析和GOUnigene的研究中，发现野生百合‘卷丹’具有最小的GOUnigene总量，但它的催化活性(Catalyticactivity)和信号转导(Transporteractivity)功能基因比重在三个品种中却是最大的，这表明该‘卷丹’在胁迫下比其它百合能更好地激活、运输或转录基因，并调控抗逆响应蛋白。在三种同源基因可视化的RNA序列分析中，发现亚洲百合‘Tiny’的同源性比东方百合‘索邦’的同源性高很多(图2)。Wang等(2015)结合生理试验结果，进一步验证了野生百合‘卷丹’和亚洲百合‘Tiny’具有更优异的抗逆性，通过这些转录组数据与生理和生化结果，推测出了野生百合‘卷丹’的基因调控和信号转导通路。

3百合响应非生物胁迫的功能

蛋白研究蛋白质组学针对蛋白质的动态变化过程进行探究，揭示了植物细胞、组织或植物体蛋白质组成及其变化规律。蛋白质组学属于功能基因组学，可以通过定性定量对研究对象进行检测，得出研究对象的表达模式。差异蛋白质组学属于蛋白质组学的一种，可以筛选对比经过不同处理后不同样本的差异蛋白表达量，从而找出存在明显差异的蛋白质(唐秀英等,2014)。在非生物胁迫条件下，百合体内的信号转导因子和转录因子会影响基因的表达，进而产生差异蛋白并影响细胞膜的渗透调节作用与物质代谢活动。紧接着百合将通过自我修复和调控恢复正常的代谢功能。所以为了深入探索百合响应外界胁迫的信号转导通路需要基于蛋白质组学的相关研究。在对百合进行高通量差异蛋白质组测序后，基于蛋白质数据库搜索和检测，对差异蛋白进行功能鉴定和分类分析，并且对不同差异蛋白与差异基因之间的关联性进行验证分析(王晶懋,2015)。研究表明，百合体内有三类功能蛋白可以响应外界非生物胁迫，其一具有减轻胁迫对细胞伤害的功能，如LEA蛋白、水通道蛋白、离子通道蛋白、渗透调节蛋白、抗冻蛋白等；其二是具有信号感应与信号转导功能的蛋白激酶，如MAP激酶、CDP激酶、受体蛋白激酶、转录调控蛋白激酶、核糖体蛋白激酶等(张彬彬,2003)；其三是可以参与信号转导且激活下游基因表达的转录因子，如MYB转录因子、WARY转录因子、DREB转录因子等。在‘卷丹’转录组COG(clusteroforthologousgro-ups)功能分析中，18736个基因通过在Swiss-Prot数据库的搜索，得到了13705基因序列可以被COG注释并分为25类(Huangetal.,2014)。在这25类之中：信号转导机制(8332,17.54%)的转录物占比最多，接着是细胞骨架(7078,14.89%)；功能预测蛋白(4239,8.92%)；翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣蛋白(3865,8.13%)；RNA加工和修饰(3518,7.4%)；细胞内运输、分泌和囊泡转运(3333,7.01%)；转录因子(63223,3.78%)；防御机制(190,0.39%)和细胞外结构(147,0.30%)等类别(王晶懋,2015)。在该转录组COG分类中，有21.5%的基因被注释到物质新陈代谢过程中，如碳水化合物、脂质、氨基酸和核酸的转运与代谢。所以，当植物受到低温胁迫时，基因表达量最多集中在物质代谢和信号转导机制中，说明控制物质新陈代谢和信号转导的基因在百合的冷应激中能够产生积极的调节效应(黄洁,2014;刘晓华,2015)。对‘卷丹’中的差异蛋白进行研究后，发现在蛋白功能分类中，有35.1%的差异蛋白属于物质代谢类；20.7%的差异蛋白属于细胞救援、抵御和胁迫反应类；12.5%差异蛋白属于能量类；10.1%的差异蛋白属于信号转导类；以上研究结果说明转录组测序的基因分类与鉴定蛋白功能分类是一致的。

4展望

百合响应非生物胁迫的分子机制比较复杂，通过转录组测序与蛋白质组学分子生物技术的介入，从分子生物学的角度对响应百合非生物胁迫的差异基因与差异蛋白进行解析与相关性分析。基于对野生‘卷丹’、东方百合‘Sorbonne’和亚洲百合‘Tiny’的GO、COG注释和KEGG通路分析，需要进一步对响应胁迫的信号转导注释基因和物质能量代谢注释基因进行深入研究。探索将来有必要对非生物胁迫下百合的响应非生物胁迫基因的表达与调控进行深入研究，进一步探索转录因子与上下游基因的关联与信号转导途径，并对目标基因进行qRT-PCR表达量分析，差异基因与差异蛋白的相关性进行分析与验证。对更多其他品种的百合非生物胁迫信号转导通路的进行验证。利用RACE技术，对转录组测序所得的更多的非生物胁迫基因片段进行全程克隆，获得基因的全长cDNA序列。在此基础上，建立百合转基因体系，构建表达载体，采用转基因技术、基因重组及表达等基因工程手段改良百合品种的抗逆性，可将转录因子导入拟南芥或烟草中进行基因超表达分析，对其他家族的转录因子与胁迫基因进行转基因验证，如DREB转录因子家族、MYB转录因子、WARY转录因子家族、MAP激酶、转录调控蛋白激酶、受体蛋白激酶，从而验证这些基因的抗逆性，建立新的转基因突变体系，进而培育出抗逆性强的百合新品种，为百合的育种、生产提供新的技术路径与支持。

作者：杨阳1；王晶懋 单位：21西安工程大学服装与艺术设计学院,2西安建筑科技大学建筑学院