漾濞泡核桃花中总黄酮含量探究范文

《大理大学学报》2016年第8期

摘要：

目的：优选漾濞泡核桃花总黄酮的提取工艺，建立漾濞泡核桃花总黄酮含量测定的方法。方法：在单因素考察基础上，用正交试验法对漾濞泡核桃花总黄酮的提取工艺优选，并以芦丁为对照品，采用差示分光光度法测漾濞泡核桃花总黄酮含量。结果：漾濞泡核桃花总黄酮最佳提取工艺为：提取溶剂50%乙醇，料液比1：20，沸水加热回流3次，每次40min；漾濞泡核桃花总黄酮浓度在11~77μg/mL范围内与吸光度成良好线性关系（r=0.9993），平均加样回收率为99.7%，RSD为1.94%，总黄酮的含量为2.16%~2.82%。结论：此方法简单、准确、稳定、可靠，可作为漾濞泡核桃花总黄酮的含量测定。

关键词：

漾濞泡核桃花；差示分光光度法；总黄酮；含量测定

泡核桃又名漾濞核桃，系胡桃亚科Juglandaceae胡桃属Juglans植物〔1〕，主要分布在云南、贵州、四川等地〔2〕。2013年3月，国家质检总局批准对漾濞泡核桃实施地理标志产品保护。核桃植株全身都是宝，除了其果仁可食用外，核桃枝、核桃花、核桃壳、核桃叶等都可入药〔3〕。核桃花即核桃花柱，又称核桃纽，长寿菜，龙须菜，含有丰富的磷脂，有益于增强人体细胞活力，促进人体造血功能，能有效降低血脂，胆固醇，预防动脉硬化，此外核桃花酊剂可治疣子〔4〕。贾忠等〔5〕从核桃花中分离鉴定了7个黄酮类化合物。赵磊等〔6〕采用HPLC-DAD对核桃花中槲皮素与山奈酚进行了含量测定，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法对兰州的核桃花总黄酮进行了含量测定。因核桃花的提取物具有较深的颜色，对测定结果影响较大，故本实验采用差示分光光度法消除背景吸收的干扰，测定漾濞泡核桃花总黄酮含量，以期为漾濞泡核桃花的进一步开发利用提供依据。

1实验仪器与试剂

1.1仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；CP224C电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；电子恒温水浴锅（上海科析试验仪器厂）；超声波清洁器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2药品与试剂

芦丁（中国药品生物制品检定研究院，批号：080-9303）；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯；漾濞泡核桃花2013年4月采于漾濞县平坡镇（由大理大学药学与化学学院杨月娥老师鉴定为JuglanssigillataDode.的花），样品编号为1#~6#，将核桃花置阴凉通风的地方自然风干，粉碎备用。

2实验方法和结果

2.1溶液制备

2.1.1芦丁对照品溶液的制备

精密称取在40℃下干燥至恒重的芦丁对照品5.5mg置于25mL量瓶中加入适量50%乙醇溶解，定容，摇匀，得0.22mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.1.2样品溶液的制备

精密称取1#样品0.5g，置100mL的烧瓶中，加入50%的乙醇溶液10mL，加热回流3次，每次40min，过滤，合并滤液后定容至50mL，即得样品溶液。

2.2测定波长的选择

精密移取“2.1.1”对照品溶液1mL和“2.1.2”样品溶液2mL，分别置于10mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.2mL摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液0.2mL摇匀，放置6min，再加入4%氢氧化钠1mL，摇匀放置15min后定容，采用差示分光光度法在400~800nm进行光谱扫描，结果表明，芦丁对照品和样品在510nm处均有最大吸收，与文献〔7-8〕报道一致，故选择510nm作为测定波长。

2.3供试品溶液制备方法的考察

2.3.1提取方法的选择

取1#样品10份（编号1至10号），每份约0.5g，精密称定，分别加入40%乙醇10mL，其中第1、2号浸泡12h后直接过滤，第3、4号浸泡12h后加热回流40min后过滤，第5、6号直接加热回流40min后过滤，第7、8号直接超声40min后过滤，第9、10号浸泡12h后超声40min后过滤，均定容至50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。结果表明加热回流提取法的黄酮提取率均大于超声提取法，浸泡12h后加热回流与直接加热回流2种提取方法吸光度接近，故本实验采用直接加热回流的方法。

2.3.2料液比的选择

精密称取1#样品7份，每份约0.5g，以3：1、6：1、9：1、12：1、15：1、20：1、25：1的料液比加入40%的乙醇，在沸水浴中加热回流40min后过滤，滤液定容为50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图1。结果表明，料液比为20：1时总黄酮提取率最大，故本实验采用的最佳料液比为20：1。

2.3.3提取时间的选择

精密称取1#样品5份，每份约0.5g，加入40%的乙醇10mL，分别在沸水浴中加热回流20、30、40、50、60min后过滤，滤液定容为50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图2。结果表明，加热回流40min时总黄酮提取率较大，故本实验采用的最佳提取时间为40min。

2.3.4提取温度的选择

精密称取1#样品6份，每份约0.5g，加入40%的乙醇10mL，分别在40、50、60、70、80℃，沸水浴中加热回流40min后过滤，滤液定容为50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图3。结果表明，随温度的增加，总黄酮提取率变大，沸水时最大，故本实验采用的最佳提取温度为沸水。

2.3.5乙醇浓度的选择

精密称取1#样品8份，每份约0.5g，加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇10mL，分别在沸水浴中加热回流40min后过滤，滤液定容为50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图4。结果用40%乙醇总黄酮的提取率最高，因此选择40%乙醇为提取溶剂。

2.3.6提取次数的考察

精密称取1#样品3份，每份约0.5g，加入40%的乙醇10mL，分别在沸水浴中加热回流1、2、3次，每次加热40min后过滤，滤液定容为50mL。分别取各试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以各样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。见图5。结果表明，随着提取次数的增加，总黄酮提取率变大，在提取3次的情况下总黄酮提取率最大，故本实验采用的最佳提取次数为3次。单因素考察泡核桃花总黄酮的提取方法为加入40%的乙醇料液比为1：20，在沸水浴中加热回流3次，每次40min。

2.4正交试验考察

在单因素试验的基础上，对核桃花总黄酮的提取工艺条件进行优化，选用L9（34）正交试验，选择提取次数（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）、料液比（D）4个因素，每个因素选择3个水平。确立因素水平见表1，结果见表2。正交试验结果表明，4种因素对提取结果影响大小依次为提取次数>提取时间>料液比>乙醇浓度。核桃花总黄酮提取最佳条件组合为A3B1C3D2，即最佳条件为50%乙醇浓度，料液比为1：20，提取3次，每次时间为40min，总黄酮提取率最高。

2.5验证性实验

精密称取1#样品3份，每份约0.5g，按正交试验的最佳条件提取样品溶液，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。结果总黄酮提取率为2.19%，RSD为1.67%。

3方法学考察

3.1线性关系考察

精密吸取芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL分别于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，在510nm波长处测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归分析，得到线性方程：Y=0.0118C+0.016，r=0.9993，结果表明芦丁在11~77μg/mL范围内线性关系良好。

3.2显色稳定性试验

取同一样品溶液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，分别放置0、0.5、1、2、4、6h，在510nm波长处测定吸光度，RSD为1.56%。实验结果表明，样品6h内显色稳定性良好。

3.3样品稳定性试验

取放置时间为0、0.5、1、2、4、6h的同一样品试液2mL，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，RSD为2.19%。实验结果表明，样品在6h内稳定性良好。

3.4仪器精密度试验

取同一样品溶液2mL，平行6份，于10mL量瓶中，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，RSD为1.05%。实验结果表明，仪器精密度良好。

3.5重复性试验

精密称取1#样品6份，每份约0.5g，按“2.1.2”项下制备样品溶液，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算黄酮提取率。测得核桃花中总黄酮平均含量为2.24%，RSD为2.05%，实验结果表明，该方法的重复性良好。

3.6加样回收率试验

取已知总黄酮含量（2.24%）的1#样品约0.25g，平行6份，精密称定，加入芦丁标准溶液适量，按“2.1.2”项下制备样品溶液，按“2.2”项下方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，计算加样回收率。见表4。

3.7样品含量测定

精密称取1#~6#核桃花粉末各3份，每份约0.5g。按“2.1.2”项下制备样品溶液，按“2.2”方法显色，以样品提取液作为空白对照，在510nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算黄酮提取率。见表5。

4讨论

目前已有文献报道核桃花内含有大量天然黑色素，且该色素易溶于水和乙醇〔9〕，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法对核桃花中总黄酮进行含量测定，但并未考虑核桃花提取液中色素对实验结果的影响。另有文献报道采用比色法测总黄酮含量时会产生较大误差〔10-11〕。预实验中，扫描未显色样品提取液，在510nm处吸光度大于0.2，测样品溶液时，以空白试剂为参比测得的吸光度比以未显色样品溶液为参比时的吸光度大。由吸光度过高或过低引起较大测量误差时采用差示分光光度法能提高其精密度、准确度、灵敏度，故本实验采用差示分光光度法。以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色，并以等量未显色的提取液作为参比，在510nm处测定漾濞泡核桃花中的总黄酮含量，消除背景吸收的干扰。该方法操作简单，有良好的稳定性、重复性和准确度。

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作者:苏敏 杨盛春 周萍 单位:大理大学药学与化学学院