浅析纳米材料上酶的固定化范文

一、用于酶固定化的磁性纳米载体

作为磁性纳米材料由于其良好的活性功能基团（如-OH、-COOH、-CHO、-NH和-SH等）可结合各种功能分子，因而在酶的固定化领域已获得了一定的应用（表1），同时磁性材料在生物医学（临床诊断、靶向药物和酶标）、细胞学（细胞标记和细胞分离等）和生物工程（酶的固定化）及分离工程等方面发展迅速［6］。这种应用与纳米材料的结构特性紧密相关，如表面较平滑、单分散性好、结构疏松等。除此之外，磁场能提供一种有效的酶回收的方法，可通过一定的磁力作用对具有磁性的纳米载体进行回收，从而提高了产物的纯度，避免了最终产品的酶污染。采用磁性纳米载体进行酶的固定对酶的酶活力和稳定性、酶结构和功能、酶特异性等酶学性质有一定的提高，但在生物催化过程中需充分考虑生物催化剂的回收利用、经济效益及副产物的处置等，以达到最优的固定化设计。Wang等［15］通过共沉淀法对Fe3O4纳米粒子进行了表面不同链长度的烷基硅烷的修饰，获得了改性的Fe3O4粒子，通过对脂肪酶的固定发现，固定化酶的活性及稳定性与增加烷基链的长度有关。Sachin等［16］用新型磁性交联的CLEAs颗粒固定了α-淀粉酶，研究发现α-淀粉酶被固定化后，其对底物的亲和力得到增强，同时也提高了酶的热稳定性和贮存稳定性，即使在贮存42d后仍能保持近100％的酶活。Zhang等［17］成功地将腺苷脱氨酶固定在金纳米（AuNP）微粒上，并用标记检测证实了二者的连接。动力学研究表明，AuNP固定的腺苷脱氨酶仍具有较好的稳定性和催化活性。Natalia等［18］探讨了利用聚合有聚乙二醇的Fe3O4磁性纳米粒子固定α-半乳糖苷酶的固定化效果。研究发现，酶与载体进行了有效的偶联，但偶联效率受纳米粒子直径大小等理化性质的影响，同时在酶的热稳定性上得到了提高。Gardimalla等［19］研究了固定在Fe2O3磁性纳米微粒上的假丝酵母脂肪酶在稳定性方面的改变，结果发现，采用Fe2O3磁性纳米微粒固定脂肪酶可以获得比游离酶更长的可重复利用时间。Hong等［20］发现在空间位阻和静电的共同作用下，结合在表面修饰的纳米金颗粒表面的α-胰凝乳蛋白酶对携带正电荷的底物表现出很强的亲和性，同时具有较高的催化活力，而对携带负电荷的底物仅表现很低的亲和力和催化活力，对中性底物的亲和力和催化能力居中。

二、非磁性纳米载体上酶的固定化

根据高分子材料的性质可将其分为无机纳米载体、有机纳米载体和复合物纳米载体等［22］。非磁性材料的磁电阻效应一般都比较低，因此在特殊的环境中能为酶的应用提供相对容易的调控，而且作为纳米级的生物催化体系，在表面积/体积比上具有独一无二的天然优势。目前，采用非磁性纳米载体进行酶的固定已取得了系列研究成果（表2），同时随着材料科学的进一步发展，必将有更多的新材料被应用于酶的固定化。使用非磁性纳米载体进行酶的固定前需用傅利叶变换红外光谱、电镜扫描、核磁共振、电感耦合技术及X射线光电子能谱等对纳米微球体作性质测定。同时为提高非磁性纳米载体的固定化效果，通常需对载体表面进行相关的分子修饰（图1），特别在以壳聚糖修饰的纳米载体方面研究较为深入［32］。黄赋等［33］用静电纺丝法制备了丙烯腈/丙烯酸共聚物（PANCAA）纳米纤维膜，以1-乙基-3-（N，N-二甲基氨基丙基）碳二亚胺/Ⅳ-羟基丁二酰亚胺（EDC/NHS）为偶联剂，在纤维膜表面引入壳聚糖修饰层，通过戊二醛将过氧化氢酶固定到壳聚糖修饰的PANCAA纳米纤维膜上，研究结果表明，在壳聚糖浓度为25mg/mL及戊二醛质量分数为5％条件下，壳聚糖修饰膜的固定化酶活性比空白膜提高了41.7％，稳定性也得到了不同程度的提高。Eldin等［34］采用沉淀聚合法将乙二胺与聚丙烯腈-共-甲基丙烯酸纳米微粒共价联接，制备了聚丙烯腈-共-甲基丙烯酸甲酯（PAN-co-MMA）微球，通过对β-半乳糖苷酶的固定化发现，其催化活性、反应稳定性、热稳定性、贮藏稳定性都有所提高。Liu等［35］报道了NAD（H）与SiO2纳米微粒的共价联接，并发现连接了NAD（H）的SiO2纳米微粒可进行多酶共固，如将谷氨酸盐脱氢酶、乳酸脱氢酶和NAD（H）固定后通过耦合反应用来催化生成α-酮戊二酸和乳酸，各种被固定的酶仍具有较好的活性和催化特性。Neri等［36］报道了用固定在聚硅氧烷-聚乙烯醇（POS-PVA）上的β-半乳糖苷酶来合成低聚半乳糖，研究发现，在pH4.5，温度为40℃条件下，低聚半乳糖的合成浓度较高，而且固定化酶可重复利用10次，并保留有原酶活性的84%。

三、纳米颗粒对核酶的固定化

脱氧核糖核酸（DNA）作为生命体的生物大分子，在生物体内发挥着储存、复制及传递遗传信息的重要功能，其碱基序列的变异与人类许多遗传疾病相关，基于DNA探针的基因传感器、基因芯片的研究正成为其中的一个研究热点。特别自1989年，诺贝尔化学奖授予ThomasR.Cech及S.Altman以来，核酸分子的自我剪切或自我剪接的分子机制得到了进一步的研究和阐述，可对于核酶的固定化目前仍处于起始阶段，但相对于其它固定化载体而言，由于通过表面修饰的纳米颗粒与DNA具有良好的生物相容性，从而增加了DNA的固定量，增强了固定化DNA的稳定性和定向性。目前DNA常用的固定化方法包括吸附法（直接吸附法、恒电位吸附法、静电吸附法、LB膜技术）、自组装膜（self-assemblySA）法及亲和素-生物素反应系统固定法［37］。常用到的纳米颗粒有纳米金、碳纳米管、纳米SiO2及ZrO2等［38］。孔德领等［39］以球形纤维素为载体，经环氧氯丙烷活化后共价偶联小牛胸腺DNA，制备DNA免疫吸附剂，利用抗体抗原特异结合原理，通过血液净化，可有效地清除患者体内DNA抗体及抗体复合物，达到治疗目的。Li等［40］则利用嵌在SiO2基质中垂直分布的碳纳米管端口的羧基共价固定DNA。刘盛辉等［41］用了氨基乙硫醇在金电极表面形成自组装单分子膜，然后用水溶性的碳化二亚胺作为偶联活化剂，ssDNA的5''''端磷酸基与电极表面自组装膜上的氨基以磷酸氨基酯键的形式共价结合，从而在金电极表面形成ssDNA单分子层，从而有效地对DNA进行了固定。Cai等［42］把多壁碳纳米管羧基化，从而在玻碳电极的表面形成了均匀的薄膜，使电极的有效面积得到了增加，再以吡咯为介质在电极表面通过电聚合包埋法固定DNA，利用杂交前后电极阻抗的变化实现了DNA的无指示剂杂交检测。

四、结语

随着纳米新材料的不断出现，特别是对复合纳米材料性质及特性的研究，为纳米材料在酶固定化领域取得更加丰硕的成果成为可能。作为纳米载体固定的酶，在酶与底物及产物的分离、酶的生物相容性、免疫活性和稳定性等方面具有独特的优势而且由于引入的表面修饰剂的功能基团易于测定和掌握，因而为酶的定向固定提供了极佳的设计思路同时也使多酶共固变得更加实际。但由于纳米载体的设计相对比较困难，而且作为固定化材料在生产成本及能源消耗等方面还存在一定的劣势，因而在后期采用纳米材料进行酶的固定过程中，应改进现有纳米材料制备的方法，同时，进一步优化纳米材料的比表面积及力学特性，增强其亲和力和生物活性，从而为改善酶的性能及提高酶的应用奠定坚实的基础。（本文作者：高启禹、徐光翠、陈红丽、周晨妍单位：新乡医学院生命科学技术学院、新乡医学院公共卫生学院）