多种材料共修饰纳米载体的研究范文

摘要：探讨两种或多种材料共修饰纳米载体的构建方法及其对体内体外靶向性的影响，并从其制剂学特性、修饰材料的选择及配合等方面进行分析。通过查阅近几年国内外文献，对两种配体结合类共修饰、配体结合类与细胞穿膜肽类共修饰、多糖类与配体结合类共修饰等不同类型的共修饰纳米载体进行了综合分析。两种或多种材料共修饰的方法具有显著提高纳米载体的稳定性、提高药物对细胞膜的穿透性和对靶点的精准性等优势。与单一材料修饰的纳米载体进行比较，共修饰纳米载体的优势更为明显。本文可为制备不同用途、类型纳米载体时合理选择修饰材料提供参考。

关键词：共修饰；纳米载体；主动靶向性；综述

纳米载体(nanocarriers)的粒径为1～1000nm，包括固体脂质纳米粒、脂质体(LP)、胶束、纳米乳、树状大分子等，其中脂质体具有提高药物生物利用度、降低药物毒性、延缓药物释放并能被动靶向释药的特点。但是，一般脂质体往往达不到器官或者细胞水平的精准靶向，同时稳定性差的缺陷也阻碍其作为靶向制剂载体的发展与应用。为了改善纳米载体的靶向性及稳定性，近年来国内外学者不断尝试对其表面进行功能化修饰，以更好地达到主动靶向的目的[1—2]。常用的靶向材料包括多糖及其衍生物类、聚乙二醇(PEG)及其衍生物、配体结合类、多肽类[3]。然而这种单一材料修饰的纳米载体易受到材料本身局限性及人体病理生理条件的影响，从而导致靶向治疗的效果不佳。针对以上问题，本文系统综述了多种材料共修饰的纳米载体，重点阐述了不同功能的修饰材料对脂质体的影响。

1两种配体结合类的共修饰

通常情况下，在肿瘤细胞表面往往存在多个与配体结合的位点。因此，采用2种特异性配体共同修饰的纳米载体具有如下的优势：①提高纳米药物与肿瘤细胞表面结合位点的结合几率；②解决单一配体饱和的问题；③克服不同类型肿瘤细胞的特异性结合问题。

1.1叶酸与转铁蛋白共修饰

叶酸(folate，F)与转铁蛋白(transferrin，Tf)在许多肿瘤细胞膜表面均具有特异性的结合位点[4—6]。肿瘤细胞增殖速度快，导致对铁元素的需求量增大，因而肿瘤细胞中叶酸受体的表达量远高于正常细胞。基于上述特点，叶酸修饰和转铁蛋白修饰的脂质体均较未修饰脂质体表现出更好的抑瘤效果[7—8]。利用转铁蛋白受体与叶酸受体在肿瘤细胞中过表达、在正常细胞中低表达的特点，Sriraman等根据导向分子的不同，分别制备了4种脂质体：PEG修饰的脂质体(PL)、转铁蛋白修饰的脂质体(TfL)、叶酸修饰的脂质体(FL)、双重修饰的脂质体[(F+Tf)-L][9]。4种脂质体粒径均小于165nm，包封率达98％以上。体外试验结果显示，(F+Tf)-L组的IC50值为25.8µmol/L，明显低于前3组脂质体(分别为65.4、56.4和35.4µmol/L)，表明该组药物诱导细胞凋亡的能力最强。在体内试验结果中，(F+Tf)-L组也表现出高的肿瘤抑制率(79％)，而其他3组的肿瘤抑制率较低(分别为42％、50％和75％)。吕清等以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)作主要磷脂成分，亦成功制备了高包封率和稳定性的转铁蛋白与叶酸双配体修饰的多柔比星(DOX)脂质体[10]。bEnd3细胞对其的摄取效率远大于普通脂质体，并且摄取过程受叶酸和转铁蛋白的影响；同时在血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)模型中的药物透过率也显著高于其他脂质体组。

1.2RGD肽与转铁蛋白共修饰

RGD(Arg-Gly-p)肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸的三肽序列，能特异性识别整合素受体αvβ3。Qin等利用整合素受体αvβ3在神经胶质瘤细胞上过表达和转铁蛋白能通过转铁蛋白受体高效穿过BBB的性质，成功构建了RGD/Tf-LP，并对其靶向性进行初步研究[11]。所制备的双配体脂质体粒径为(128±13.0)nm，z电位为(-2.67±1.85)mV。体外细胞摄取试验表明，bEnd3细胞对RGD/Tf-LP的摄取率是RGD-LP和LP的3.2倍(该细胞对RGD-LP和LP的摄取率几乎一致)。脑胶质瘤细胞(C6)对RGD-LP、Tf-LP、RGD/Tf-LP的摄取率亦明显高于LP(分别是2.7、2.4和8.6倍)。体外肿瘤球模型模拟试验显示，共修饰脂质体进入肿瘤球的能力最强。在荷瘤裸鼠脑组织的近红外荧光成像试验中，可以直观地观察到共修饰脂质体组的脑部肿瘤组织蓄积最多。邵云等也做了类似研究，推测转铁蛋白和RGD共修饰脂质体具有一定的脑胶质瘤靶向性，可作为一种潜在的脑胶质瘤给药载体[12]。综上所述，构建2种特异性配体修饰的脂质体，可利用多种特异性配体同时识别定位靶细胞，实现对靶向受体的协同作用。同时，减少对非靶细胞的识别，降低对非靶向细胞的毒性作用。

2配体结合类与细胞穿膜肽类(CPP)共修饰

2.1叶酸、转铁蛋白与CPP类共修饰

转铁蛋白受体在肿瘤细胞表面具有饱和性，叶酸在生理条件下透膜性能极低[13]，这也就大大限制了纳米药物进入肿瘤细胞的效率。理想的肿瘤靶向药物传递系统不仅需要在全身给药后将药物浓集在肿瘤组织，还需要将药物有效地传递到肿瘤细胞内，从而将治疗作用最大化并减轻抗肿瘤药的不良反应。TAT肽(transcriptionalactivatorprotein)是一种常用的细胞穿膜肽，可以通过非共价键结合的方法实现大分子物质的胞内递送并保留其活性[14]，但不能区分肿瘤细胞和正常细胞的缺点限制了其应用。将TAT和特异性配体Tf共同修饰在脂质体表面，可以互补各自的劣势。文献对比研究了Tf/TAT-LP、TAT-LP和Tf-LP对缩小肿瘤球体积作用的影响[15—19]。结果显示，共修饰脂质体对肿瘤球的生长抑制作用显著强于单独修饰脂质体和普通脂质体。类似地，通过试验对比证实了F-TAT-LP较普通脂质体而言，对肿瘤细胞的抑制作用和被细胞摄取的能力亦明显增强[20—22]。

2.2RGD肽与CPP类共修饰

整合素受体αvβ3除在神经胶质瘤细胞上高表达外，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等多种实体瘤细胞表面亦有高水平的表达[23]。文献报道的RGD肽与TAT肽共修饰脂质体的粒径均小于150nm，对紫杉醇的包封率大于80％[24—25]。细胞摄取试验显示，共修饰脂质体的摄取效率明显高于RGD肽或TAT肽单独修饰的脂质体。蔺伟等采用薄膜分散法制备RGD肽和TAT肽共修饰的载microRNA-34a脂质体(RGD/TAT-miLPs-34a)，荷瘤裸鼠体内试验显示RGD/TAT-miLPs-34a组的肿瘤生长抑制率为73.7％，远高于TAT-miLPs-34a组的42.6％和RGD-miLPs-34a组的39.6％[26]。经RGD肽和TAT肽共修饰能增强脂质体的入胞能力，增强载药脂质体对肿瘤细胞增殖的抑制力。

3PEG与CPP、配体结合类共修饰

3.1PEG与CPP类共修饰

PEG可显著延长药物载体在体内的循环时间，通过增强渗透和滞留(enhancedpermeabilityandretention，EPR)效应将药物蓄积在肿瘤部位，PEG修饰的脂质体被广泛用于纳米系统的构建[27—28]。药物的聚乙二醇化(PEGylation)是将活化的PEG通过化学方法偶联到药物的过程，即PEG修饰。疏水性的小分子抗肿瘤药经PEG修饰后，可增加其水溶性[29]，但PEG修饰也减弱了药物穿透细胞膜的能力，而与细胞穿膜肽的结合正好可以弥补此项不足[30]。当还原敏感型可断裂PEG-TAT共修饰脂质体在肿瘤组织中高度蓄积后，外源性给予还原剂半胱氨酸(Cys)可使PEG从脂质体表面断裂脱离，显著提高了药物进入肿瘤细胞的效率[31—32]。肿瘤细胞外的pH值(6.5～6.8)普遍低于正常组织和血液(pH7.2～7.4)，这是由于肿瘤细胞的增殖分化能力强，肿瘤部位供氧不足，使得葡萄糖在缺氧条件下转化为乳酸造成的[33]。因此可以利用肿瘤组织这一特殊微环境构建pH敏感型PEG与细胞穿膜肽共同修饰的靶向药物传递系统。文献报道，当预孵育时间为2h时，肿瘤细胞对pH6.5和pH6.0预孵育条件下的共修饰脂质体摄取率是pH7.4预孵育条件下的3.8倍以上[34—35]。

3.2PEG与配体结合类共修饰

在聚合物类修饰材料中，PEG是最为常用的修饰材料。PEG有2个末端羟基可通过化学键与药物分子间形成不稳定的化合物，如pH敏感型PEG、酶敏感型PEG、氧化-还原敏感型PEG等[29]。将上述配体连在PEG长链上，可起到靶向性与长循环的加和作用。岳枫等制备了氧化-还原敏感的可断裂PEG与RGD肽共修饰脂质体(C/RGD-LP)，粒径为(104.8±5.5)nm，z电位为(-4.45±1.75)mV，在血清中有良好的稳定性[36]。加入还原剂Cys后PEG断裂，该组细胞的荧光强度显著强于未加入Cys组和无RGD肽修饰的普通脂质体组(P<0.01)。结果显示，脂质体表面大量PEG的存在能够有效屏蔽RGD肽，保持脂质体的稳定性。谢黎崖等利用离子交联和化学交联相结合的方法制备壳聚糖纳米粒(NPs)，并对NPs分别进行了叶酸和PEG修饰[37]。修饰后的NPs(F-NPs、PEG-NPs及F+PEG-NPs)粒径不受功能基团修饰的影响，激光共聚焦试验证明F+PEG-NPs能显著提高细胞对粒子的摄取。F+PEG-NPs有望成为一种新型的药物载体，用于抗肿瘤药对肿瘤细胞的主动靶向。黄微等将肝靶向分子甘草次酸偶联至PEG-聚乳酸-羟乙基酸共聚物(PLGA)上，采用溶剂挥发法制备肝靶向纳米粒。结果表示，该纳米粒无明显细胞毒性，且甘草次酸的引入能显著增加肝癌细胞对纳米粒的摄取几率[38]。

4多糖类与配体结合类共修饰

在肝主动靶向系统中，去唾液酸糖蛋白受体(GPR)目前研究较多，它能特异性识别末端带有半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺基的糖链，其中每个肝细胞上的GPR结合位点超过5×105个[39]。由GPR介导的单靶制剂研究工作已经取得了较大的进展[7,40—41]。在病理条件下，GPR的密度和活性都会降低，从而导致与肝癌细胞的结合量降幅达95％以上[42]，因此单纯由GPR修饰的载体材料常出现转运率低、被受体特异性识别能力差的问题。陈厚翔成功合成了双配体修饰的壳聚糖(CTS)材料——乳糖酸化甘草次酸壳聚糖(GCGA)[43]，并通过体外细胞摄取试验研究了BEL-7402人肝癌细胞对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的GCGA、甘草次酸壳聚糖(GA-CTS)和CTS纳米粒的摄取情况。结果显示，细胞对双配体的GCGA纳米粒的摄取量高于单配体的GA-CTS纳米粒，并明显高于无配体修饰的CTS纳米粒。当一种受体介导的内吞作用因病理生理条件的影响受阻时，还可以发挥另一种受体介导的主动靶向作用，从而提高肝癌靶向的可靠性。人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxy-nucleotide，CpG-ODN)具有激活机体免疫系统的作用，能直接诱导浆细胞样树突状细胞的活化和成熟，单独应用CpG-ODN具有抗肿瘤作用[44]。赖春慧将软脂酸与甘露糖胺通过脱水缩合反应生成甘露糖酯，进而与脂质体反应制备甘露糖酯修饰的脂质体(mannose-conjugatedliposomes，M-Lipo)；采用后插法将CpG-ODN连接至M-Lipo，得到M/CpG-ODN-Lipo，进一步包裹肝癌H22细胞裂解物得到脂质体M/CpG-ODN-H22-Lipo[45]。该脂质体粒径为130nm，呈球形，包封率为52.9％，可有效抑制肝癌小鼠肿瘤生长并延长其生存时间。

5其他共同修饰类

5.1以PLGA为纳米载体的共修饰

PLGA是聚乳酸、羟基乙酸按不同配比制成的高分子聚合材料，具有良好的生物相容性和缓释特性，在体内的降解产物多以二氧化碳和水的形式排出，对人体无毒、无刺激性，已被广泛用于抗肿瘤药物载体的研究中[46]。王琳等系统综述了PLGA作为紫杉醇药物缓释载体的研究进展，通过与传统化疗制剂的对比表明，PLGA利用静脉注射、间质给药等方式能发挥更好的抗肿瘤效果[47]。此外，PLGA还能提高肽类和蛋白质类药物的口服生物利用度。Zhu等采用细胞穿膜肽类(R8、TAT和Pen)和分泌肽(secretionpeptide，Sec)分别修饰PLGA胰岛素纳米粒[48]。与普通纳米粒相比，细胞穿膜肽类修饰的PLGA纳米粒(Pen-NPs)和二者共同修饰的PLGA纳米粒(Sec-Pen-NPs)显著提高了胰岛素在回肠的吸收率(1.86和3.18倍)。CPP-PLGA纳米粒还能帮助胰岛素跨越BBB，这是一种潜在的神经退行性疾病的治疗载体[49]。李宗祥等采用乳化法制备了Tf和RGD肽共修饰PLGA纳米粒(Tf/RGD-NPs)，其粒径为(113.4±12.5)nm，z电位为(4.53±2.15)mV[50]。体外细胞摄取试验表明，黑素瘤B16细胞对Tf/RGD-NPs的摄取效率分别为对Tf-NPs和RGD-NPs的2.7和2.9倍，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结果显示，该纳米粒具有良好的黑素瘤癌靶向性。

5.2以聚酰胺-胺(PAMAM)为纳米载体的共修饰

PAMAM树状大分子是一类新型的三维结构高分子材料，具有粒径大小可控、单分散性、无免疫原性、生物可降解性等特点，其作为药物载体具有粒径小、高通透和滞留效应强、稳定性好、载药量高等优点，通过靶向分子修饰能主动靶向于特定的组织、细胞或某些特定的靶点，达到增效减毒的效果[51]。李晶晶等基于PAMAM树状大分子，通过化学合成制得叶酸、冰片(borneol，BO)共修饰新型纳米载体(F-BO-PAMAM)，并包载抗肿瘤药DOX以达到增加药物对BBB的透过性和提高对脑胶质瘤靶向性的目的[52]。在体外释放试验中，分别考察了F-BO-PAMAM/DOX在模拟生理环境(PBS，pH7.4)和肿瘤环境(PBS，pH5.5)中的释药行为。相较于原料药，F-BO-PAMAM/DOX释药缓慢，在肿瘤环境下50h内累积释放率达62.1％。体外跨BBB转运180min后，DOX、PAMAM/DOX、BO-PAMAM/DOX和F-BO-PAMAM/DOX的转运率分别为4.71％、4.82％、14.17％和13.35％。F-BO-PAMAM/DOX发挥了对脑胶质瘤的逐级靶向作用。胡文以第4代PAMAM为聚合物骨架材料，通过二硫键将PEG连接在PAMAM的表面，合成了不同PEG化程度的PAMAM-SS-PEG聚合物(PSSP)，然后以DOX为模型药物制备了PAMAM-SS-PEG/DOX(PS/DOX)复合物[53]。载药前后其粒径和z电位均未发生明显变化。体内释放结果表明，PSSP/DOX复合物具有明显的还原和pH敏感性，并且DOX的释放程度随着PEG化程度的增加而增加。作者成功构建了集长循环、主动靶向、还原和pH敏感释药等功能于一体的聚合物释药系统。

6小结与展望

在修饰纳米载体中，对提高靶向性起至关重要作用的就是修饰材料的选择。目前，对于选择修饰材料时仍有以下问题需要考虑：①2种修饰材料之间及修饰材料与载体之间的偶联方法、空间位阻等；②修饰纳米载体的处方组成、药物的选择及对粒径的影响；③修饰纳米载体的载药量和包封率；④修饰纳米载体的体内和体外靶向性的确定；⑤修饰纳米载体的细胞毒性。与单一材料修饰的纳米载体和普通纳米载体相比，多种材料修饰的纳米载体制备过程更为复杂。多种材料结合共修饰的纳米载体已经取得了较大的进展，国内外学者从修饰材料的合成、体内体外靶向性的检测到药物在体内释放时间的测定等方面都取得了较大的进步。多种材料修饰的纳米载体可以利用多种靶向功能，增强药物的入胞和跨越屏障的能力、延长药物在体内的循环时间、使药物更多地浓集于靶区，增强靶向性。随着对修饰材料研究的不断深入，纳米载体的临床应用性也将会更加广泛。

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作者：周莉莉；邹蔓姝；乔勇；夏新华 单位：湖南中医药大学药学院