酵母分泌系统改造策略及优点范文

工程化改造方法往往先考虑宿主的筛选和启动子/信号肽的优化，通过改造一般会使蛋白质分泌水平提高3～10倍。然而即使当蛋白质转录、翻译水平以及宿主均达到最优水平时，许多蛋白质的表达量仍然相对较低，这表明外源蛋白分泌不仅仅是一个蛋白质合成的过程，还涉及很多复杂的调控过程，涉及初生蛋白的共转录及转录后的内质网定位、内质网内的蛋白质折叠及监控、内质网及高尔基体内的翻译后糖基化修饰、胞内蛋白的转运和分选及蛋白酶降解等过程，因此通过遗传修饰对宿主菌的工程化改造成为提高蛋白质表达量的最有效的手段。随着后基因组技术的发展和系统生物学方法的应用，菌株工程化改造研究得到了极大的发展［6］。本文主要从内质网内蛋白质折叠及监控过程和胞内蛋白运输途径的角度综述酵母分泌系统工程化改造的研究进展。

1内质网内蛋白折叠及监控过程的工程化改造

1．1蛋白质胞内分泌过程

蛋白质的胞内分泌过程起始于通过SEC61易位子向内质网的共转录或转录后转运过程，进而在内质网内折叠形成天然结构，此过程受到严格的监视调控［7～10］。初生蛋白进入内质网后，与kar2基因编码的分子伴侣结合蛋白BiP相结合折叠成天然结构，同时与cnei基因编码的钙连接蛋白结合辅助其正确折叠并进行N-糖基化加工，此外在内质网内还可进行一系列共价修饰，包括信号肽加工、二硫键形成、N-糖基化、蛋白降解及分选等。经折叠及修饰加工后，只有正确折叠组装的蛋白可以从内质网转运入高尔基体，在高尔基体中经进一步修饰加工后被转运到胞外、液泡或其他细胞器，而发生错误折叠或形成多聚体的蛋白质则会被内质网监控系统识别，并与BiP复合物结合进而进入胞质中被降解，此过程被称为内质网相关的蛋白质降解(ERAD)［11］。一部分错误折叠的蛋白质与BiP的结合更为持久，会诱发非折叠蛋白反应(UPR)［12］，促进内质网相关的蛋白质水解过程，并抑制蛋白质的转录和转运过程。

1．2内质网蛋白质折叠监控体系构成

内质网驻留蛋白质折叠和监控体系主要包括五类要素:辅助蛋白质折叠的分子伴侣(如BiP、钙连蛋白和钙网蛋白等)、辅助蛋白质形成正确构象的酶(如二硫键异构酶PDI)、ERAD相关蛋白降解机制、UPR相关信号通路和参与翻译后修饰的酶。

1．3工程化改造

由于存在复杂严格的监控体系，蛋白质折叠往往成为外源蛋白分泌最主要的限速瓶颈，而折叠和监控体系也成为菌株工程化改造的主要对象。内质网蛋白质折叠和监控系统的复杂性和严格性与很多基因相关，对其进行遗传修饰比较困难。因此一种更为直接有效的方法是过表达多种分子伴侣、二硫键异构酶及其他辅助折叠因子。已有研究表明，过表达一种Hsp70家族的分子伴侣BiP可以促进外源蛋白在酿酒酵母中的分泌，人红细胞生成素的表达量可提高5倍［13］，牛凝乳酶的表达理论上可提高26倍［14］;而降低BiP的水平会导致外源蛋白分泌水平下降［15］。但分子伴侣对蛋白质分泌的影响并非适用于所有情况，具有蛋白质或宿主特异性，有些研究也发现过表达分子伴侣对蛋白质的分泌有负面的影响。如多形汉逊酵母过表达BiP使黑曲霉葡萄糖氧化酶的胞外表达水平降低了10倍［16］，可能的解释是，由于分子伴侣系统存在级联效应，Bip过表达可能会阻抑其他分子伴侣的作用，另外过表达也会增加其与靶蛋白持久结合的可能性，从而促进了内质网相关的蛋白质水解过程而非蛋白分泌过程。其他一些辅助因子也对蛋白分泌具有调控作用。共伴侣分子DNAJ及其他因子(如SLS1/SIL1和LHS1)可以调控BiP的ATP酶活性，影响其参与的多种功能，包括易位子门控、初生蛋白折叠、错误折叠蛋白靶向降解、非折叠蛋白反应调控和内质网钙储存等。在酿酒酵母中，过表达单一或多种共伴侣分子，如JEM1(一种DNAJ同源蛋白)、SIL1、LHS1和SCJ1，可以显著提高重组人白蛋白rHA、重组人转铁蛋白rTf及GM-CSF的表达量［17］。二硫键异构酶PDI和巯基氧化酶等对于蛋二硫键的形成具有重要作用，过表达PDI可以提高某些蛋白的分泌水平［18］，同时过表达PDI和分子伴侣蛋白对于转铁蛋白的分泌表达提高具有协同效应［19］。在粟酒裂殖酵母中，提高两种PDI的水平可以显著提高转铁蛋白的分泌水平［20］，增加PDI和聚泛素蛋白基因水平也可以极大提高人血白蛋白的表达水平，但对IL-1β的表达没有影响［21］。另一种促进分泌的方法是调节UPR信号通路调节蛋白Hac1。非折叠或错误折叠蛋白在内质网中发生累积，通过HAC1诱发非折叠蛋白反应，从而激活分子伴侣表达并抑制目的蛋白的分泌。酿酒酵母过表达里氏木霉hac1基因时，芽胞杆菌α-淀粉酶的分泌量提高了2．4倍［22］;酿酒酵母hac1基因过表达可使内源转化酶分泌量提高2倍，重组α-淀粉酶产量提高70%［22］;过表达hac1选择性剪接形式(hac1i)可以提高3种重组蛋白的分泌［17］。然而令人意外的是，过表达共分子伴侣(sil1，lhs1，jem1和scj1)反而会使hac1i转录水平降低2倍，hac1表达的破坏会使α-淀粉酶和内切葡聚糖酶EGI的分泌分别减少75%和50%，但对内源转化酶分泌量没有影响［22］。这些结果表明，hac1过表达对分泌的影响具有蛋白质或宿主特异性，而且HAC1蛋白与其他分子伴侣之间存在复杂的调控关系。

2胞内蛋白质运输通路的工程化改造

2．1蛋白质胞内运输过程

蛋白质胞内转运过程包括初始共翻译、翻译后转位入内质网内腔，以及随后逐步膜泡运输过程(内质网向高尔基体、高尔基体内部、后高尔基体转运)。蛋白质在内质网中正确折叠后主要通过包膜运输小泡进行选择性运输，因此胞内蛋白质运输一般称为膜泡运输或膜运输。新合成的蛋白质往往被有选择地浓缩到不同的膜泡群体中，进而靶向不同的受体，称为蛋白靶向或蛋白质分选。分泌运输早期从胞质向内质网的转运是蛋白质运输通路中不可忽视的重要环节。在酵母中，存在两条由胞质向内质网的靶向转运途径:共翻译转运途径和翻译后转运途径。信号肽对于蛋白质的靶向转运是必须的，其由一段长度为15～50个氨基酸的片段组成，通常有一个疏水核心、一段带正电的N端及一段亲水的C端。在共翻译转运途径中，一旦信号肽N端暴露出来，核糖体－新生蛋白链复合物会通过信号识别颗粒(SRP)和其受体(SR)被转运到内质网上的易位子通道;而酵母分泌蛋白主要选择翻译后转运途径，这是由于这些蛋白质的信号肽疏水性不强，合成时逃脱了SRP的识别，这些蛋白质从核糖体上释放出来后被胞质分子伴侣及共伴侣识别，以维持其非折叠或松散折叠的状态，直到通过易位子通道，这意味着过表达胞质分子伴侣和核糖体结合因子可能会对蛋白质分泌有一定的作用。

2．2工程化改造

2．2．1信号肽优化早期分泌过程中，蛋白质靶向的特异性主要由分泌信号肽的疏水核心及其与胞质内SRP的相互作用所决定，因此对应每一种宿主系统都开发了多种类型的N端分泌信号肽和酵母特异的前导氨基酸序列，信号肽剪切位点在内质网和高尔基体中被一步一步加工处理，以确保目的蛋白从胞质经内质网到高尔基体的正确转运。源于酵母信号肽的应用可以提高外源蛋白的分泌水平。源于酿酒酵母的前导信号肽α因子包含一个连续两个碱性氨基酸位点，此位点可以被高尔基体中的内切蛋白酶识别，应用此信号肽可以获得对外源蛋白的高效分泌表达。酿酒酵母信号肽MFα可以提高纤维素酶Eg1和血管内皮生长因子在酵母中的分泌水平［23，24］。在酿酒酵母和毕赤酵母中，应用绿色荧光蛋白和其他异源蛋白作为报道蛋白对不同的信号肽序列进行比较发现，α因子更适用于外源蛋白的分泌表达［25，26］。Liang等［27］通过分析酵母内源性蛋白的信号肽，发现了3种可能的分泌信号序列，这些信号序列与α因子一样，可以促使绿色荧光蛋白和其他异源蛋白有效的分泌。其他来源的信号肽有些也适用于酵母系统，例如应用里氏木霉自身疏水蛋白HFBI和HFBII序列作为分泌信号可以获得较高水平绿色荧光蛋白的分泌［28］。对某些无法有效进入内质网的蛋白质，优化信号肽序列是最有效的提高分泌水平的方法。然而有些时候信号肽的优化也无法有效地引导靶蛋白进入内质网，研究表明除N端信号肽外，信号锚定序列的性质也对蛋白质的运输方式具有决定作用，因此将目的蛋白与某些其他蛋白、亚结构域、标签蛋白或信号锚定肽进行融合表达也有利于蛋白质分泌。

2．2．2运输通路改造胞内运输每个步骤中膜泡的正确靶向都受许多胞内膜蛋白的控制，并决定最终的整体分泌水平，因此当存在运输效率低或分选错误的情况时，对于运输通路的遗传优化是最先考虑的改造方式。有些情况下，尽管蛋白质已经进入内质网并进行正确折叠后也无法从胞内分泌出来，这表明在从内质网到高尔基体或后高尔基体运输过程中还存在其他的限制因素。这两个过程涉及大量膜蛋白，其中一部分功能还不明确，因此明确蛋白在胞内运输过程中的限制环节是工程化改造的首要步骤。有研究发现当人生长激素在裂殖酵母中进行表达时，有部分激素蛋白滞留于胞内，这主要由从高尔基体到液泡的错误分选造成。液泡蛋白分选受体VPS10在这一分选过程中起主要作用，VPS10也是液泡羧肽酶CPY的受体，所以其介导的液泡分选途径也被称为CPY途径。在晚高尔基体中，液泡定位的各种酶主要通过结合Vps10从而与分泌蛋白分离，这表明存在VPS10介导的错误分选使分泌蛋白积累于液泡中的可能。在酵母中也有类似的报道，vps10基因缺失对于某些外源蛋白的分泌有正面影响［29］，而对于胰岛素融合蛋白没有效果，而缺失其他五种vps基因(vps4、vps8、vps13、vps35和vps36)却可以提高其分泌水平。这表明除VPS10途径外还存在其他的液泡分选途径，如需要接头蛋白AP3和VPS41参与的碱性磷酸酶(ALP)途径等，可见液泡分选途径也具有蛋白质特异性，对其进行遗传修饰还需要对相关基因功能有进一步的系统研究。尽管运输过程进行遗传修饰已经成为一种可能的宿主工程化方式，但目前还难以通过修饰一个或少数几个基因来达到对蛋白运输的完全控制，而且这种修饰常会影响细胞的活性。

2．2．3融合表达对于某些难以进入分泌途径的融合蛋白，往往可以通过融合标签或其他促分泌蛋白来进行改善。Ahn等［30］报道通过在N端融合一段来自于哈茨木霉内切葡聚糖酶Ⅱ的细胞膜结合结构域(CBD)，可以使嗜热脂肪芽胞杆菌脂肪酶L1在酿酒酵母中的分泌量提高7倍，在高密度发酵条件下分泌表达水平达到1．3g/L;进一步发现在CBD和L1之间插入一个Kex2酶切位点仍然表现出相同的提高水平，由于此酶切位点在高尔基体中被识别剪切，因此推测CBD结构域主要在从内质网到高尔基体转运的过程中起作用。此外在酿酒酵母中融合表达类芽胞杆菌纤维素酶和细胞壁蛋白Pir4的不同结构域，也实现了该蛋白在酿酒酵母中的成功表达［31］。因此当菌株或靶蛋白改造难以起效时，融合表达也是一种有效的改善蛋白质分泌水平的手段。

3展望

在已经发展成熟的酵母表达载体和发酵工艺基础上，对蛋白质分泌途径的系统化修饰已经成为一种常用的酵母分泌体系改造策略。基因组技术的快速发展将会为酵母体系的进一步改造提供新的更为系统化的信息和解决方案。可以期待的是，经过进一步优化的酵母体系必将会为药用蛋白的工业化生产带来重大突破。

作者：常亮刘晓志孟雅娟马志珺高健单位：华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室